Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Mikrodialyse av etanol under operant etanol selvadministrering og etanol Bestemmelse med gasskromatografi

doi: 10.3791/4142 Published: September 5, 2012

Summary

En metode for å bestemme tidsforløpet av etanolkonsentrasjonen i hjernen til rotter under operant etanol selvadministrering er beskrevet. Gasskromatografi med flamme ionisering deteksjon blir brukt for å kvantifisere etanol i dialysatet prøvene, fordi den har følsomheten kreves for de små volumer som er generert.

Abstract

Operante Selvadministrering metoder blir ofte brukt til å studere de atferdsmessige og farmakologiske effekter av mange legemidler av misbruk, inkludert etanol. Imidlertid er etanol typisk selv-administrert oralt, i stedet intravenøst ​​som mange andre legemidler av misbruk. Farmakokinetikken til oralt administrerte legemidler er mer komplekse enn intravenøst ​​administrerte legemidler. Fordi forstå forholdet mellom de farmakologiske og atferdsmessige virkninger av etanol krever kjennskap tidsforløpet av etanol når hjernen under og etter å ha drukket, bruker vi in ​​vivo mikrodialyse og gasskromatografi med flamme ionisering deteksjon å overvåke hjernen dialysatet etanol konsentrasjoner over tid.

Kombinert mikrodialyse-behavioral eksperimenter innebære bruk av flere teknikker. I denne artikkelen, stereotaksiske kirurgi, atferdstrening og mikrodialyse, som kan tilpasses til å teste en rekke selvadministrering og neurochemical sentrert hypoteser, er inkludert bare for å illustrere hvordan de forholder seg til de påfølgende faser av prøvetaking og dialysatet etanol analyse. Dialysatet etanolkonsentrasjonen analyse via gasskromatografi med flamme-ionisering deteksjon, som er spesifikke for etanol studier, er beskrevet i detalj. Data produsert av disse metodene avslører mønsteret av etanol når hjernen under selvadministrering prosedyre, og da sammen med nevrokjemiske analyse av de samme prøvene dialysatet, tillater konklusjoner som kan gjøres om de farmakologiske og atferdsmessige virkninger av etanol.

Protocol

1. Stereotaksiske kirurgi

  1. Alle prosedyrer følger NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité.
  2. Ved hjelp av en stereotaksisk anordning, godt håndtert Long-Evans rotter bedøvet med isofluran, er implantert med en 21-gauge kanyle (for senere microdilaysis probe innsetting) (Plast One, Roanoke, VA) ovenfor hjernen regionen av interesse, og et tjore bolt er bygget inn i hodet scenen (brukt til å støtte mikrodialyse utstyr).
  3. Overvåke rotter nøye under og etter operasjonen. Sørg for at alle dyr får minst én uke med post-kirurgisk behandling og gjenvinning, og er sunt før du begynner følgende prosedyrer. En Jove video av stereotaksiske kirurgi metoden er tilgjengelig. En

2. Operant trening

  1. Etter en uke med post-kirurgiske utvinning, er dyr opplært til spaken trykk for 10% sukrose solution i en Med Associates operant kammer (MedAssociates, Inc., Vermont, USA) utstyrt med en lickometer, uttrekkbar spaken, og sipper tube (som tidligere beskrevet i Howard et al., 2009). 2 Programvare fra MedAssociates brukes til å designe alle operante programmer (MedAssociates, Inc., Vermont, USA).
  2. Gang opplært til å svare for sukrose, begynner rotter på en passende KURSKALENDER der etanol blir gradvis tilsatt til løsningen over flere drikking økter.
  3. For eksempel bruker vårt lab øyeblikket en 8-dagers KURSKALENDER der etanol er falmet til løsningen kulminerer i en 10% etanol / 10% sukrose drikking løsning. Kontrolldyr bare motta 10% sukrose eller ingen drikking løsning. Den spesifikke type operant tidsplan skal brukes kan variere mye, men den generelle prosedyrer som er beskrevet nedenfor for mikrodialyse prøvetaking kan fortsatt utføres. 3

3. Pre-mikrodialyse Prosedyrer: tethering

Natten før den nest siste treningsøkt (i vårt eksempel er dette det 7. treningsøkt), er dyr habituated til tether våren, som festes til tjore bolt på hodet scenen. Fjæren festes til mikrodialyse svivel og motvekt vektarm, som er suspendert ved buret med en ring stativ og klemmene slik at dyret kan bevege seg fritt innenfor buret sitt. Tethered dyr tilbringe natten i operant rom, i deres hjem bur med ad libitum mat og vann, for å tilvenne dem til tethering set-up.
  • Neste dag, fullfører rotte sin operant program med tjore på plass, for å tilvenne dyret til følelsen av fortøyningen mens du utfører sine atferdsmessige oppgaver. Monter tethering apparatet til veggen av operant kammeret nær toppen for å tillate suspensjon av fortøyningen og svivel ovenfor sentrum av taket av operant kammer. Alt dette er plassert inne i lyddempende kammeret. After økt, returnere rotta til sitt hjem bur i operant rom å avvente microdiaysis probe innsetting.
  • 4. Pre-mikrodialyse Prosedyrer: The mikrodialyse proben er satt dagen før mikrodialyse eksperimentet etter rotte har fullført atferdstrening for dagen

    1. Dagen før mikrodialyse eksperimentet, har etter rotte gjennomført en operant økt mens tethered, bedøve rotta med isofluran og fjerne obturatoren fra guiden kanylen. Langsomt (over ~ 5 min) settes det mikrodialyse probe, perfused med kunstig cerebral spinalvæske (ACSF), gjennom den kraniale guiden kanylen inn i hjernen regionen av interesse. Vi bruker laboratorie-bygget prober og mikrodialyse prosedyrer modellert etter Doyon et al., 2003 og Pettit og Justice, 1991. 3, 4
    2. Bruke den tidligere diskuterte tethering apparat å suspendere innløp-og utløp linjer av sonden over dyret.
    3. Slå pkappen strømningshastighet ned til 0,2 pl / min. Igjen, tilbringer rotte natten i operant rommet.

    5. Mikrodialyse Prosedyrer: Samling av prøver under selvadministrering økt med appetitive og consummatory faser skilt

    1. Minst 2 time før forsøket begynner, skru opp sonden til arbeidstemperatur strømningshastighet. Vi bruker enten 1,0 eller 2,0 pl / min avhengig hjernen regionen. Kontroller at sonden strømningshastighet er konsistent, og minst 90% av den innstilte strømningshastighet ved hjelp av en Hamilton sprøyte å måle volum over tid.
    2. Dialyse prøver (5 eller 7 minutter) er tatt før, under og etter den operant økt. Samplingsintervallet avhenger hjernen regionen, idet nevrotransmitter analysert, dialysatet konsentrasjonen av analytten, og følsomheten for den analytiske kjemi utstyr som skal benyttes for analysen. De atferdsmessige faser er som følger:
      1. Baseline: Ved begynnelsen av forsøket,samle dialyse prøver i dyrets home bur (4 prøver).
      2. Transfer: Etter samling av hjemme bur baseline prøvene, overføre rotte til operant kammer. Overføring av tethered rotte krever ekstrem forsiktighet for å sikre at mikrodialyse væskeoverføring linje ikke blir flokete, og at rotta er fortsatt rolig. Umiddelbart etter overdragelsen, aktivere operant program som du endrer fra grunnlinjen / overføring prøven til første ventetiden prøven.
      3. Vent: Fortsett å samle inn prøver som Rotta venter på spaken for å strekke seg inn i kammeret (3-4 prøver avhengig hjernen regionen).
      4. Drikke: Når spaken er presentert og trykket inn, en flaske drikke løsning (10% sucrose/10% etanol eller 10% sukrose) gjort tilgjengelig for rotte for rundt 20 minutter (3-4 prøver).
      5. Post-drink: Etter drikke periode, forblir flasken trekkes, men rotte in operant kammer for rundt 20 minutter (3-4 prøver).

    6. Mikrodialyse Prosedyrer: Utarbeidelse av mikrodialyse prøve for etanol analyse

    1. To prøver før dyr selvadministrere etanol løsning, og alle prøvene etter, blir vurdert for etanolkonsentrasjonen. Pipetten enten 1 eller 2 pl alikvot fra prøven av interesse inn en 2 ml hetteglass. Deretter forsegle flasken med en lufttett septum (9 mm Rød Poly skrukork, PTFE / Sil Septa, Agilent Technologies). Volumet av etanolen analysen delmengde (1 eller 2 pl) avhengig av totalt prøvevolum, og prøven volum som kreves ytterligere analyser.
    2. Hvis prøvene skal brukes for senere nevrokjemiske analyse, lagre prøven hensiktsmessig etter pipettering alikvoten for etanol kvantifisering.
    3. For eksempel, analyserer lab prøvene for dopamin. For å oppnå dette, plasserer prøvene på tørris under eksperimentetog deretter, lagre prøvene ved -80 ° C etter at eksperimentet. Vi bruker 2 ul aliquoter for etanol analyse av en 5 min prøve samles ved hjelp av en strømningshastighet på 2,0 pl / min for sonder plassert i nucleus accumbens. Dette tillater minst 7 pl gjenværende for senere analyse av dopamin ved høyytelse væskekromatografi med elektrokjemisk deteksjon.
    4. For prøver tatt fra den prefrontale cortex, som har mye lavere ekstracellulære dopamin konsentrasjoner, bruker vi en 1 pl alikvot for etanol analyse tatt fra en 7-min prøven ved hjelp av en strømningshastighet på 1,0 pl / min.

    7. Post-mikrodialyse prosedyrer

    1. Etter avslutningen av mikrodialyse eksperimentet, anesthetize rotte og fjern proben. Erstatt obturatoren hvis dyret ikke umiddelbart avlives. Samle hjernen innen tre dager etter eksperimentet. Ellers kan visualisering av sonden tarmkanalen ikke være mulig.
    2. Hjernen bør fjernes in samsvar med godkjente dyr bruk protokoller. Vi bruker natriumpentobarbital (150 mg / kg, ip) overdose, etterfulgt av hjerte perfusjon med saltløsning og deretter formalin i saltvann. Senk hjernen i en formalin-saltvannsoppløsning i minst 12 timer før snitting.
    3. Coronally delen hjernen til 100 mikrometer skiver. Stain skiver med Cresyl fiolett, og undersøke for riktig probe plassering. 5, 6

    8. Analyse av prøver for etanolkonsentrasjonen

    1. De innsamlede prøvene samt eksterne standarder (0,3125 til 20 mM etanol) kjøres på vår gasskromatograf med flamme ionisering detection system. Dette systemet består av en Varian CP 3800 gasskromatograf med en flamme ionisering detektor, et Bruker (Varian) 8400 headspace autosampler oppvarmet til 50 ° C, og en HP Innowax kapillarkolonne (30 mx 0,53 mm x 1,0 um film tykk), med helium som mobil fase.
    2. Kromatogrammer blir registrert og analysert med Chromatography programvare som Varian stjerne Kromatografi Workstation programvare som vil bli spesielt diskutert her.
    3. For å klargjøre systemet for etanol analyse, oppvarme autosampler plate ved hjelp av en resirkulerende vannbad, og åpne de to ekstra gasstankene (luft og hydrogen; helium er alltid igjen kjører å bevare voks kolonne).
    4. Spille gasstanken press, samt antall prøver du har tenkt å kjøre, slik at du kan holde telling av antall ganger fiber og septum har blitt brukt slik at de kan bli endret når det passer (fiber-500 injeksjoner; septum -100 punkteringer).
    5. Initiere oppstart metode, som klargjør systemet til å kjøre prøver (programparametere i tabell 2). Vent til systemet for å rapportere at det er "klar".
    6. Initiere en 20-min "brenne", som forbereder fiber for prøveanalyse ved å underkaste den en høy temperatur for å desorbere enhver forurenser det har absorbert mens resten.
    7. Standarder er laget avfortynne 238 ul 95% etanol med vann til et endelig volum på 100 ml ved hjelp av en volumetrisk kolbe i avtrekkskap. Dette skaper en 40 mM etanol løsning. Vi bruker en 1:1 seriefortynning å opprette 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 mM standarder. For hver konsentrasjon av standard, bruker du samme volum delmengde som vil bli tatt fra dialyse prøvene. Pipetter alikvoten i en 2 ml hetteglass, og deretter forsegle hetteglasset med en lufttett septum.
    8. Alle etanol prøver oppvarmet i autosampler inntil hele væsken delmengde er fordampet. Vi varmer våre prøver i ca 30 min.
    9. Denne delen beskriver Star Workstation-programvaren som vi bruker med våre gasskromatograf. Annen programvare kan brukes, men beskrivelsen nedenfor, kan ikke være aktuelt.
    10. Hvis du vil kjøre prøver, lage en liste med merke seg hvilken prøve er der autosampler sporet, og hvor mange ganger prøven skal punkteres. Pass på å rute datafiler til valgt foldeh. Deretter velger du metoden for valg for dine prøver, og begynne kjøringen. Vi bruker de kjører parametere nevnt i Tabell 2.
    11. Vårt dialysatet etanol programmet absorberer prøven i 3 min og desorbs inn helium strømmen, som strømmer inn i voks kolonnen, i 1 min. Men, kan programmer bli skrevet for å imøtekomme dine spesifikke behov.
    12. De prøvekomponenter separate i voks-kolonnen, og deretter gå gjennom flammen ioniserings detektoren der karbonholdige forbindelser, slik som etanol, forbrenn og slipp ioner. Dette resulterer i økt elektron flyte fra detektorens anoden til katoden skape en strøm, som blir omdannet til spenning og fart som resulterer i kromatogrammer som vist nedenfor (figur 1). Endringen i spenningen er proporsjonal til mengden av karbon som passerer gjennom detektoren tvers time.7
    13. Etter at systemet er ferdig prøvene må du sjekke integrering av hver topp. For Star Workstation,Klikk på den blå topp ikonet på verktøylinjen. Klikk på hver topp farge og dra pilene for å justere den opprinnelige planen. Reintegrere hver topp før du flytter til neste gruppe av topper. Toppen analyse programvare kan være noen generell kromatografi programvare.
    14. For Star Workstation, klikk på batch rapporten ikonet i verktøylinjen. Dra hver prøve fra angitte mappen til batch rapporten til å skrive ut eksempelrapportene. Rapportering programvare kan tilpasses med de vanligste kromatografi programvaresystemer.
    15. Rapportene kan være programmerte til å vise informasjonen du ønsker. For tiden bruker topphøyde, men rapportene kan også programmerte til bruke topparealet.
    16. Å slå av systemet, starte shut-down metoden (parametre nevnt i tabell 2), slå av vannbadet, og lukk hydrogen og luft tanker når kolonnen ovnen temperaturen når 30 ° C.

    9. Etanol data

    1. Plotte topphøyden somen funksjon av hver kjent ekstern standard etanolkonsentrasjonen (figur 2A). Bruke den lineære funksjonen gitt av disse punkter for å beregne etanolkonsentrasjonen fra topphøyden gitt av hver dialysatet prøve.
    2. Ved å plotte konsentrasjonen av etanol i dialysatet over tid, kan vi se et mønster av etanol nivåer i hjernen regionen av interesse i løpet av vår atferdsmessige sesjon. Eksempeldata, vist nedenfor (figur 2B), er representert som konsentrasjonen av etanol i dialysatet over tid under selvadministrering sesjon.

    10. Generelt vedlikehold: The fiber bør endres hver 500 punkteringer, og septum hver 100 punkteringer

    Å endre fiber

    1. På gasskromatograf tastaturet trykker Menu, velger 8400, trykk enter, velg endre sprøyte, trykk enter. Den autosampler vil posisjonere seg slik at fiber (SPME Fiber Assembly, 75 mikrometer Carboxen-PDMS, Supelco Analytisk, BellefoNTE, PA) som skal fjernes.
    2. Åpne døren dekker fiberen. Skru låsemutteren, og flytte låsen for å tillate fiberen montering for å bli fjernet. Ta fiber forsiktig ut. Skru av mutteren som holder fiber i forsamlingen, og deretter skrur fiber.
    3. Erstatt den gamle fiber med en ny, og montere fiber forsamlingen. Erstatte forsamlingen i autosampler, re-låsing og skru montering på plass. Når du er ferdig, trykker du på "endre gjort" på tastaturet, og autosampler vil klare seg selv i bruk.

    Hvis du vil endre septum

    1. Først, skru av lokket som dekker septum (Hi-Temp 0.450 Dia. Generic Conditioned Septa, Varian) og deretter fjerne den gamle septum. Seat den nye septum ned i beslaget. Re-skru av korken og skru det fast med skiftenøkkelen. Deretter bruker en injeksjonsnål for å punktere septum slik at fiberen ikke vil bryte den første gangen septum er punktert.
    2. 11. Representant Resultater

      Figur 1 viser eksempel kromatogrammer for tre konsentrasjoner av etanol standarder og for en rotte dialysatet prøve samles ved slutten av etanolen selvadministrering sesjon. Etanol topper bør være relativt symmetrisk, har konsekvent retensjonstider, og et signal til støy-forhold> 10. Unnlatelse av å oppfylle disse kriteriene betyr at systemet krever vedlikehold. Kvalitet kromatografi og fullstendig forberedt standarder produsere en lineær standardkurve (R2 ≥ 0,99, Fig. 2A) som brukes til å beregne konsentrasjonen av etanol dialysatet prøver samlet fra etanol selv administrere dyr i løpet av deres selvadministrering økt (figur 2B) .

      Figur 1
      Figur 1. Eksempel kromatogrammer. Ett mikroliter etanol standard eller dialysatet prøve ble lastet inn i en gass chromatograph hetteglass og analysert som beskrevet i teksten. A) Overlay av topper generert fra 2,5, 5,0 og 10 mM etanol standarder. B) Peak generert fra en dialysatet prøve fra en rotte som har selvadministrert etanol.

      Figur 2
      Figur 2. Grafiske resultater fra eksempel eksperiment vist i figur 1. A) Etanol standardkurve. B) Tidsforløpet for dialysatet etanolkonsentrasjonen over en etanol selvadministrering sesjon.

      <tr>
      Hardware Parameter Oppstart innstilling Kjører innstilling Resting innstilling
      8400 Bruker (Varian) Autosampler
      Injeksjon modus Spme Spme n / a
      Løsemiddel inntrengningsdybde 0% 20% n / a
      Eksempel stikkedybde 20% 20% n / a
      Absorpsjon tid 0,01 min 3 min n / a
      Desorpsjon tid 19 min 1 min n / a
      Rengjør modus løsemiddel kilde Jeg Jeg n / a
      Clean-modus adsorpsjon og desorpsjon tid 0,01 min 0,01 min n / a
      Vannbad (varmer autosampler) * 50 ° C 50 ° C Av
      CP-3800 Varian Gas Chromatograph
      Injektor Oven Ovnen makt
      Ovnstemperaturen 250 ° C 220 ° C 30 ° C
      Kolonne Oven Stabilisering tid 0,10 min 0,10 min 0.10min
      Temperatur 65 ° C 65 ° C 30 ° C
      Kolonne Mobil fase flow rate 8,5 ml / min 8,5 ml / min n / a
      Kolonne Pressure ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi
      FID detektor Ovnen makt
      Temperatur 220 ° C 220 ° C 120 ° C Elektronikk Av
      Tidskonstant Rask Rask Rask
      Range 11 11 11
      Autozero Ja Ja Ja

      Tabell 2. Gasskromatograf med flamme ionization Detection System parametere. Denne tabellen viser parametrene for de tre programmene som brukes til å forberede (oppstart innstillinger), kjøre (kjører innstillinger) og vedlikeholde systemet mens ikke er i bruk (hvile innstillinger).

    Discussion

    Søknader og begrensninger

    Drug selvadministrering brukes i gnagere til modell narkotikaavhengighet. Mange legemidler av misbruk som modelleres på denne måten kan bli administrert intravenøst, hvori medikamentet blir levert direkte til den sentrale kammer. Dette gjør det mulig for tett oppfølging av dosen over en selvadministrering økt. Siden etanol er vanligvis muntlig selvadministrert, er det mye vanskeligere å overvåke narkotika nivåer på grunn av individuelle forskjeller i absorpsjon og metabolisme. Ved å bruke mikrodialyse til prøven fra hjernen regionen av interesse, er vi ikke bare i stand til å overvåke et mønster av etanol nådde regionen, men vi er også i stand til å samtidig overvåke nevrotransmitter endringer i samme region over tid i løpet av hver selvadministrering fase.

    Nevrokjemiske endringer og narkotikainduserte svar i hjernen er knyttet til rusmisbruk og avhengighet, derfor muligheten til å samtidig measikker nevrokjemiske og narkotika konsentrasjoner under bestemte Selvadministrering faser gir en svært kraftig og unikt verktøy. Ett problem å huske på for å korrelere dialysatet konsentrasjoner av analytter med atferd er de fysiske egenskapene til mikrodialyse avløp. Nærmere bestemt er den tiden det tar for væske til å bli overført fra lumen av mikrodialyse proben til samlingen røret kritisk, og kortere tider er bedre. I vårt laboratorium, konstruerer vi sondene slik at tiden er ca 90 sekunder. Ved hjelp av disse forhold, er det funnet at det er en accumbal dopaminøkning ved innledningen av etanol forbruk, som avtar i løpet av drikke og post-drink perioder som dialysatet etanolkonsentrasjonen øker. 2,3,8,9 Disse eksperimentene , når kombinert med data fra farmakologiske studier har tillatt oss å sortere ut de strengt farmakologiske effekten av etanol og selvadministrering knyttet miljømessige signaler på lmanges i Nevrotransmitter konsentrasjoner.

    Det bør bemerkes at denne bruken av kombinerte atferds-mikrodialyse teknikker er egnet til dagens forskning interesser vårt laboratorium. Den er utformet for å evaluere den temporale mønster av etanol når hjernen i forhold til mønsteret av nevrotransmitter endringer i samme region, slik at vi kan relatere disse tiltakene til synkrone selvadministrering atferd. De utledet dialysatet etanol konsentrasjoner er ikke korrigert for in vivo-probe utvinning, og er bare en brøkdel av hjernen etanol vevet konsentrasjon. Hvis kvantitativ mikrodialyse etanol er nødvendig, bør ekstraksjonen fraksjonen av etanol som diffunderer fra det ekstracellulære rom i sonden bli eksperimentelt bestemt. Se tidligere publikasjoner fra vårt laboratorium for metoder og videre diskusjon. 10,11,12

    Selv denne protokollen illustrerer bruken av gass lmromatography sammen med fast fase microextraction etanol fra frivolumet mikrodialyse prøver, kan andre metoder for analyse av etanol innhold mikrodialyse prøven brukes. Imidlertid kan alternative metoder lider av noen ulemper. For eksempel, kan mindre følsomme analytiske metoder krever et større prøvevolum som nødvendiggjør prøvetaking ganger større enn 5-7 minutter er illustrert her. Av type system omtalt her bruker en fast fase microextraction som konsentrerer etanolen i dampfasen i den forseglede prøven hetteglasset ved at absorpsjon til fiberen plasseres i hetteglasset headspace. Dette forbedrer deteksjonsgrensen forhold til direkte headspace prøvetaking som typisk lar 50-100 mikroliter av dampen som skal injiseres. En annen stor fordel med headspace metoden er at prøven injiseres for analyse er meget ren og fri for salter. Direkte injeksjon av væsken mikrodialyse prøven kan også brukes med høyere SensITivity, men dette vil kreve mer instrument nedetid på grunn av vanlig vedlikehold som kreves for å rense ut de injiserte salter.

    Feilsøking og andre notater

    1. Før eksperimentet begynner, gi deg selv god tid til å sjekke at mikrodialyse set-ups fungerer som de skal, og for å feilsøke eventuelle problemer. Vi foreslår at du har en ekstra set-up, perfused med ACSF, klar til å bytte ut med en funksjonsfeil set-up for å spare tid, som de fleste operante økter tendens til å oppstå på et bestemt tidspunkt hver dag.
    2. Være sikker på at de mikrodialyse prober inn over en periode på omtrent 5 min for å minimere vevsskaden produsert ved skjærbehandling av vevet som sonden penetrerer hjernen.
    3. Ved overføring av rotte i operant kammeret er det nyttig å ha en ekstra person bistå slik at overføring linjen (del av mikrodialyse oppsett) ikke blir sammenfiltrede, og slik at operant programmet kan initiated i tide.
    4. Sørg for at du gir autosampler vannbad god tid til å nå riktig temperatur. Vårt system krever vanligvis to timer å nå 50 ° C. Også sikre at dine prøver er fullt fordampet før analysere prøvene. Vi vanligvis visuelt bekrefte at dette har skjedd før oppstart prøveanalysen.
    5. Standard gode analytiske kjemi praksis bør følges. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, validering av individer, utstyr og prosedyrer. I korte trekk, ansetter vi følgende retningslinjer: Individuelle brukere bør vise evne til å generere reproduserbare topphøyde verdier for standard konsentrasjoner og lineære standardkurver (R2 ≥ 0,99) over flere dager. For å verifisere GC-FID systemet fungerer riktig, bør standardene være alltid analyseres før noen dialysatet prøver injisert. Standardkurven genereres bør ha en R2 ≥ 0.99.
    6. Det meste av utstyret vi brukerble kjøpt gjennom Varian, Inc., som ble kjøpt opp av Agilent Technologies i 2010. På denne tiden, fikk Bruker vitenskapelige instrumenter Varian laboratorium gasskromatografi instrumenter virksomhet. For fremtidige kjøp, ta kontakt selskapet.
    7. Denne protokoll viser operant atferd med rotter, men betrakteren bør være klar over at flere avbrudd av atferd er sannsynlig med mindre mus modell. Et annet problem å være klar over er at plassering av en mikrodialyse sonde inn i hjernen andre regioner enn den mediale prefrontal cortex eller nucleus accumbens kan forstyrre operant atferd i større grad enn det som vises her. Det er viktig å nøye undersøke mange atferdsmessige parametere for å bestemme dersom skaden forårsaket av sonde plassering produserer alvorlige endringer i oppførsel.

    Disclosures

    Denne artikkelen ble finansiert av Med Associates, Inc.

    Acknowledgments

    Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra NIH / Niaa (AA11852 og AA007471).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    95% Ethanol AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY E190, 111000190
    Ultra-Pure Sucrose MP Biomedicals, LLC, Solon, OH 821721
    Ultra High Purity Helium Air Gas HE UHP300
    Air Air Gas AIZ300
    Hydrogen Air Gas AIZ300
    GC 2 ml vials Agilent Technologies #8010-0015
    GC vial caps with PTFE/silicone septa Agilent Technologies #8010-0084
    Table 1. Specific reagents

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).
    2. Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Gonzales, R. A. The dopamine response in the nucleus accumbens core-shell border differs from that in the core and shell during operant ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 33, 1355-1365 (2009).
    3. Doyon, W. M., York, J. L., Diaz, L. M., Samson, H. H., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatory phases of oral ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 27, 1573-1582 (2003).
    4. Pettit, H. O., Justice, J. B. Effect of dose on cocaine self-administration behavior and dopamine levels in the nucleus accumbens. Brain Res. 539, 94-102 (1991).
    5. Paxinos, G., Kus, L., Ashwell, K. W. S., Watson, C. Chemoarchitectonic Atlas of The Rat Forebrain. Academic Press Inc. (1998).
    6. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press Inc. (1986).
    7. Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis. 5th Edition, Thomson Learning, Inc. (1998).
    8. Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens. J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).
    9. Carrillo, J., Gonzales, R. A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling. Alcohol. 45, 559-5566 (2011).
    10. Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration. Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).
    11. Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain. J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).
    12. Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum. Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).
    Mikrodialyse av etanol under operant etanol selvadministrering og etanol Bestemmelse med gasskromatografi
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).More

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter