Summary
छोटे और चौड़े कोण एक्स - रे बिखरने प्रक्रिया (SWAXS) के प्रदर्शन जैविक अणुओं के अध्ययन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई बन गया है. विशेष कोण के तरीकों और तैयारी के उपकरण और प्रक्रियाओं के प्रयोग के माध्यम से, SWAXS से प्रयोगात्मक डेटा अणुओं की परमाणु और नैनो पैमाने लक्षण वर्णन प्रदर्शित करता है.
Abstract
इस पत्र में, छोटे और चौड़े कोण अणुओं की एक्स - रे बिखरने विश्लेषण (SWAXS) प्रयोग के माध्यम से प्रदर्शन किया है. और व्यापक कोण (आमतौर पर> 5 °) - SWAXS एक तकनीक है, जहां एक्स - रे elastically छोटे (5 ° आम तौर पर 0.1) कोण पर एक एनएम रेंज में inhomogeneous नमूना से बिखरे हुए हैं. इस तकनीक को आकार, आकार, और बड़े अणुओं, आंशिक रूप से आदेश दिया सामग्री, ताकना आकार और सतह करने वाली मात्रा अनुपात की विशेषता दूरी के वितरण के बारे में जानकारी प्रदान करता है. छोटे कोण एक्स - रे बिखरने (SAXS) 1 और 200 एनएम के बीच अणुओं की संरचनात्मक जानकारी देने में सक्षम है, जबकि चौड़े कोण एक्स - रे बिखरने (WAXS) 0.33 एनएम और 0.49 एनएम के बीच के आधार पर भी छोटे नमूने की Bragg रिक्ति को हल कर सकते हैं विशिष्ट प्रणाली सेटअप और डिटेक्टर. रिक्ति Bragg कानून से निर्धारित किया जाता है और तरंगदैर्ध्य और घटना कोण पर निर्भर है.
, एक SWAXS प्रयोग में सामग्री ठोस हो सकता हैया तरल और ठोस, किसी भी संयोजन में एक ही है या किसी अन्य सामग्री के तरल या गैस डोमेन (कणों तथाकथित) हो सकता है. SWAXS आवेदन बहुत व्यापक हैं और सभी प्रकार के colloids धातु, कंपोजिट, सीमेंट, तेल, पॉलिमर, प्लास्टिक, प्रोटीन, खाद्य पदार्थ, और दवाइयों. ठोस नमूने के लिए, मोटाई लगभग 5 मिमी तक सीमित है.
एक प्रयोगशाला आधारित SWAXS साधन का उपयोग इस पेपर में विस्तृत है. के लिए उपलब्ध सॉफ्टवेयर SWAXS प्रणाली (जैसे, GNOM - ATSAS 2.3 डी. EMBL-हैम्बर्ग और EasySWAXS सॉफ्टवेयर Svergun द्वारा पैकेज) के साथ, एक प्रयोग करने के लिए दिए गए नमूने के लिए ब्याज की कुछ मापदंडों का निर्धारण करने के लिए आयोजित किया जा सकता है. एक जैविक macromolecule प्रयोग का एक उदाहरण है जो चुना जा सकता है और कई तरीकों के माध्यम से तैयार एक पानी आधारित जलीय बफर में 2% wt लाइसोजाइम का विश्लेषण है. नमूने की तैयारी नमूना अनुभाग की तैयारी में नीचे दिए गए दिशा निर्देशों के बाद. SWAXS प्रयोग के माध्यम से,लाइसोजाइम की महत्वपूर्ण संरचनात्मक मानकों परिचलन की त्रिज्या उदा विश्लेषण किया जा.
Protocol
1. नमूने की तैयारी
- एक सुई का प्रयोग नमूना कंटेनर से नमूना के कुछ दूर *.
- सुई का उपयोग करने के लिए केशिका भरने के नमूने के साथ (2.2 मिमी की अधिकतम व्यास). केशिका नीचे से 2 और 3 सेमी के बीच भरा होना चाहिए.
- मोम पिघल द्वारा अपने नोक पर केशिका बंद करें.
- वैक्यूम सिस्टम से नमूना धारक खोलना.
- जुड़े अंत (मोम अंत) द्वारा केशिका लो और नमूना धारक में अंत में संयुक्त राष्ट्र से जुड़े डालें.
- धारक प्रणाली और जगह में पेंच में वापस जगह.
* ठोस नमूने (पाउडर नमूने सहित) सीधे नमूना धारक में (कोई केशिका आवश्यक) रखा जा सकता है, जबकि तरल नमूने एक केशिका में रखा जाना चाहिए.
शुरू हुआ SWAXS मशीन
2. स्रोत ठंड स्टार्टअप प्रक्रिया
- सुरक्षा शटर बटन धक्का द्वारा शटर बंद करें.
- मुख्य शक्ति स्विच"पर" बटन पर हरे रंग धक्का.
- आपातकाल "बंद" बटन सत्यापित विस्तारित स्थिति में है.
- पर हरे बटन धक्का द्वारा मुख्य शक्ति स्विच.
- सत्यापित करें गूंथ एलईडी प्रकाश हरी है, यह दर्शाता है सभी interlocks ठीक कर रहे हैं.
- टच स्क्रीन के लिए प्रतीक्षा करने के लिए लोड करने के लिए. एक बार जब यह भरी हुई है, मेनू पर "R6" दबाएँ.
- "पर" स्थिति स्टैंडबाय कुंजी मुड़ें.
- एक्स - रे "पर" स्थिति के लिए महत्वपूर्ण मोड़. लाल बत्ती की एक्स - रे प्रकाश चाहिए.
- टच स्क्रीन के लिए प्रतीक्षा करने के लिए standby स्तर (30 केवी और 0.4 मा) को पढ़ने के लिए.
- स्टैंडबाय सुरक्षा "ऑफ" स्थिति के लिए महत्वपूर्ण मोड़ है. टच स्क्रीन के तल पर "प्रारंभ चक्र" बटन दबाएं.
- टच स्क्रीन के लिए प्रतीक्षा करने के लिए नाममात्र शक्ति (50 केवी और मा 1) को पढ़ने के लिए. यदि एक अलग शक्ति स्तर वांछित है, विन्यास स्क्रीन टच स्क्रीन पर "R4" दबाने और इच्छित सेटिंग्स में प्रवेश में प्रवेश.
3. Chiller प्रक्रिया
- शक्ति swi मुड़ेंतापमान नियंत्रण पैनल पर "पर" स्थिति के लिए दर्पण. एक नियंत्रण प्रकाश और एलईडी तापमान प्रदर्शन प्रकाश होगा.
- Chiller पर स्थिति "पर" पावर स्विच को चालू करें.
- रुको जब तक तापमान प्रदर्शन पढ़ता "बंद." यह standby मोड है.
- प्रेस और पकड़ के बारे में 4 सेकंड के लिए या जब तक तापमान प्रदर्शन दर्ज बटन (वापसी प्रतीक) एक वास्तविक तापमान इंगित करता है.
- तापमान परिवर्तन, ऊपर या नीचे तीर दबाएँ. निर्धारित मूल्य लगभग 8 सेकंड के लिए तापमान प्रदर्शन पर दिखाया जाएगा इससे पहले कि यह वास्तविक मूल्य के लिए वापस आ जाएगी.
- प्रेस बटन दर्ज करें एक बार वांछित निर्धारित मूल्य प्रदर्शित होता है. इसका मतलब यह है कि मूल्य की दुकान होगी.
- रुको जब तक वास्तविक तापमान वांछित निर्धारित मूल्य तक पहुँचता है.
नोट: यदि किसी भी समय त्रुटि "ई 01" तापमान प्रदर्शन पर पता चलता है, टैंक fil में शुद्ध पानी गिरने से Chiller Shutdown निर्देश, फिर से भरना स्नान इकाई का पालन करेंएल, और फिर chiller स्टार्टअप प्रक्रिया फिर से प्रदर्शन करते हैं.
4. Chiller की बंद
- लगभग 4 सेकंड के लिए "प्रवेश" दबाएं.
- "ऑफ" स्थिति के लिए बिजली का स्विच बंद.
5. वैक्यूम पर टर्निंग
- सुनिश्चित करें कि वैक्यूम दरवाजा जगह में सुरक्षित है.
- "पर" पदों के लिए 1 वैक्यूम और 2 knobs मुड़ें.
- रुको जब तक VAP5 वैक्यूम गेज एक वैक्यूम स्तर कम से कम 1.5 एम्बार पढ़ता है.
6. वेक्षक सिस्टम सेटअप
- गैस के दबाव सेट सत्यापित करने के लिए, वाल्व की कमी मुख्य दबाव गेज कम से कम 10 बार है.
- मुख्य वाल्व खोलें.
- धीरे धीरे आपरेटिंग दबाव वाल्व खोलने जब तक दबाव आपरेटिंग दबाव गेज में 8 बार तक पहुँचता है.
- दूसरा मुख्य वाल्व खोलें
- गैस के प्रवाह को समायोजित करने के लिए, गैस कंट्रोल पैनल पर ऊर्ध्वाधर स्थिति घुंडी बदल मुख्य दबाव वाल्व खुला.
- प्रवाह समायोजितसुई वाल्व के साथ दर जब तक गेज लगभग 8 बार पढ़ता है.
- "पर" स्थिति के लिए मुख्य पावर स्विच बंद. एलईडी प्रकाश प्रकाश चाहिए.
- उच्च वोल्टेज को समायोजित करने के लिए, "पर" स्थिति के लिए स्विच मोड़ द्वारा उच्च वोल्टेज सक्रिय. एलईडी प्रकाश प्रकाश चाहिए.
- धीरे धीरे वोल्टेज नियंत्रण घुंडी बारी तक लगभग 3.5kV गेज पर पहुँच जाता है. DO 4kV को पार.
7. अंशांकन
- प्रयोगात्मक ऊपर कदम ज्ञात चोटियों के एक नमूना के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं.
- एएसए 3.3 तीव्रता बनाम 5 चोटियों के साथ चैनल के ग्राफ को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- मेनू पर जाएँ → विकल्प → चैनलों और इसी तीव्रता दर्ज करें.
- ASA3 जाओ, 1 "TPF" टैब.
- फ़िल्टर बदलने के लिए, शीर्ष 1 मिमी निकल (बीम फिल्टर) छोड़ दिया है.
- स्थिति ३२,००० (बत्तीस हज़ार रेंज 28,000, 28,000 के आसपास महत्वपूर्ण क्षेत्र) सेट → स्थिति में जाना, यकीन है कि वैक्यूम नीचे 5 एम्बार सुनिश्चित करें कि डिटेक्टर इसकी वजह हैडिंग 1K-10K के बीच.
- प्रति सेकंड लगभग 52 की गिनती के लिए 10 सेकंड के लिए चलाएँ.
- ऊर्जा, खिड़कियां, (या केवल नमूने के साथ नहीं फिल्टर मामले सहित ऊर्जा खिड़की, मापने के लिए) बदलें. 10 सेकंड के लिए अंतिम समय सेट.
- प्राथमिक बीम (उदाहरण के लिए चैनल 233) के स्थान का पता लगाएं.
- दूसरे रन के लिए, फिर से 2 मिमी टंगस्टन (डब्ल्यू, बीम डाट) फिल्टर और 30,000 से शुरू बदल जाते हैं.
- नमूने के सभी अन्य चोटियों के स्थान का पता लगाएं.
- ImageJ - मैक्रो सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए SAXS जांचना तीव्रता बनाम चैनल से तीव्रता बनाम क्ष (या घ अंतर) संक्रमण बनाने (1 चित्रा).
- ImageJ - मैक्रो सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए WAXS जांचना तीव्रता बनाम चैनल से तीव्रता बनाम क्ष (या घ रिक्ति) संक्रमण बनाने (2 चित्रा).
8. सॉफ्टवेयर प्रक्रिया
- सॉफ्टवेयर एएसए 3.3 का प्रयोग करें, जीना डेटा इकट्ठा: लाइव डेटा → TPF टैब → फ़ाइल सहेजें.
- EasySWAX लिएएस, डिवाइस सेटिंग्स टैब पर क्लिक करें.
- "एक", लैम्ब्डा, और घ मूल्यों, गुरुत्वाकर्षण के केंद्र के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दर्ज करें.
- प्वाइंट collimation चुनें.
- गोलाकार कण प्रकार का चयन करें (जब तक यह एक फ्लैट आकार कण की एक छड़ी होने के लिए जाना जाता है).
- Guinier - प्लॉट टैब पर क्लिक करें. एक मैं बनाम क्ष 2 ग्राफ प्रदर्शित किया जाएगा.
- ऊर्ध्वाधर लाइनों लगभग रैखिक ढाल के एक खंड के चारों ओर खींचें.
- स्क्रीन के तल में एक अनुसंधान मूल्य प्रदर्शित किया जाएगा. यह करने के लिए अगले एक सत्यापन की आवश्यकता है.
- ऊर्ध्वाधर लाइनों को करीब एक साथ खींचें जारी रखें जब तक मान्यता मूल्य 1 और 2 के बीच है. यह व्यक्तिपरक है. आर मूल्य, या परिचलन की त्रिज्या, प्राप्त एक अनुमान है.
9. स्रोत बंद प्रक्रिया
- सुरक्षा जाँच करना और तेजी से shutters बंद हो जाती हैं.
- "पर" स्थिति स्टैंडबाय कुंजी मुड़ें.
- टचस्क्रीन के लिए प्रतीक्षा के लिए अतिरिक्त स्तर को पढ़ने के लिए.
- टी पर प्रेस R5ouchscreen.
- 0 ए के लिए वर्तमान में कमी
- 0 ए वोल्टेज कम
- एक्स - रे "ऑफ" स्थिति के लिए महत्वपूर्ण मोड़.
- मुख्य शक्ति "बंद" स्विच लाल बटन बंद धक्का द्वारा.
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Representative Results
SAXS: घुमाव, कण आकार और आकार, समाधान संरचना कारक, विशिष्ट भीतरी सतह और ताकना आकार, जाली प्रकार और आयाम, और इलेक्ट्रॉन घनत्व 1 की त्रिज्या और WAXS निम्नलिखित मानकों के माध्यम से पूरी तरह नमूना के संरचनात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं. SAXS और WAXS भी प्रोटीन 2 गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.
SWAXS प्रयोगों की संरचनात्मक जानकारी प्रयोगात्मक पता लगाया स्पेक्ट्रा और प्रणाली के कम्प्यूटेशनल परिणाम की तुलना करके प्राप्त किया जाता है. कम्प्यूटेशनल परिणाम के साथ एक उचित प्रभावी संभावित वी (नि.) eff Ornstein Zernike (औज़) अभिन्न समीकरण सिद्धांत (रेफरी से इस तरह के विश्लेषण का एक उदाहरण देखा जा सकता है.) 3 के रूप में सांख्यिकीय यांत्रिकी, मॉडल से विकसित सॉफ्टवेयर में गणना की गई .
डेटा विश्लेषण के तरीकों, मॉडल के भाग के रूप में SWAXS पूर्ण तीव्रता मैं (क्यू) के लिए अध्ययन के लिए सॉफ्टवेयर, में विकसित करने की आवश्यकता होगी, जहां बिखरने तीव्रता, मैं (क्यू), बिखरने वेक्टर क्ष, पारस्परिक अंतरिक्ष में गति हस्तांतरण के एक समारोह है = 4π पाप (/ 2 θ) / λ क्ष. जो बिखरने कोण, θ, और विकिरण की तरंग दैर्ध्य λ, से जुड़ा है एक अदिश मात्रा है. क्ष 0.03 की रेंज में निहित है - एक चयनित दूरी नमूना डिटेक्टर के साथ एक ठेठ SAXS प्रयोग में 0.6 -1 एक. असली अंतरिक्ष में जांच क्षेत्र के आकार r = 2π / क्ष क्ष के लिए संबंधित है, और 11-2000 रेंज में एक 4 है. WAXS, दूसरे हाथ पर, 3.3 एक मैं (क्यू) परमाणु सुविधाओं और परमाणु बिखरने केन्द्रों की स्थिति पर निर्भर करता है से बड़ा अंतर को हल कर सकते हैं. SWAXS प्रयोग में, 1 मापा तीव्रता बनाम चैनल क्विंटल या रिक्ति घ बनाम तीव्रता calibrated किया जाना चाहिए (1 चित्रा और 2% wt पानी आधारित जलीय बफर में lysozyme के SAXS विश्लेषण का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है. परिचलन की त्रिज्या के लिए मूल्य प्राप्त और 3 चित्र में दिखाया लगभग 1.44 5 एनएम की उम्मीद मूल्य अच्छी तरह से तुलना करता है. SAXS जैविक अणुओं के लिए कैसे लागू करने के उदाहरण refs से पाया जा मई 06-13. जलीय घोल में छितरी liposome के WAXS विश्लेषण का एक उदाहरण 4 चित्र में दिखाया है. बढ़ रही है क्यू के साथ समान रूप से स्थान कम चोटियों, lamellar संरचना करने के लिए पानी आधारित समाधान जलीय नमूना में liposome बख्शी है. प्रत्येक lamellae के साथ, वहाँ बिखरने में एक कमी है कि हो जाएगा है. 
चित्रा 1ImageJ मैक्रो सॉफ्टवेयर के साथ SAXS अंशांकन. इस्तेमाल नमूना घ रिक्ति 48.68 के साथ एक चांदी stearate है. प्राथमिक किरण चैनल 367 पर स्थित है और पांच प्रमुख चोटियों (या नमूना की जाली मापदंडों) 539 पर स्थित हैं, 717, 896, 1075, और 1253 चैनलों, क्रमशः. 
चित्रा 2. ImageJ - मैक्रो सॉफ्टवेयर के साथ WAXS callibration. इस्तेमाल नमूना पैरा Bromo Benzoic एसिड पाउडर है. छह प्रमुख चोटियों (या नमूना की जाली मापदंडों) 130, 484, 555, 613, 657, और 902 चैनलों, क्रमशः में स्थित हैं. 
चित्रा 3. पृष्ठभूमि - घटाया SAXS lysozyme के कच्चे डेटा (2 wt%). से Guinier EasySWAXS सॉफ्टवेयर साजिश बहुत कम क्ष का उपयोग कर सकते हैं 
4 चित्रा पृष्ठभूमि - घटाया WAXS liposome के कच्चे डेटा एक पानी आधारित जलीय घोल में छितरी हुई है. चित्रा 4A में दिखाया गया है. liposome के संरचना के योजनाबद्ध चित्र (1D परतदार), अपने सिर हाइड्रोफिलिक और hydrophobic पूंछ, अपने फॉस्फोलिपिड झिल्ली ढेर, और इसके इलेक्ट्रॉन घनत्व समारोह 4B चित्रा में दिखाए जाते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
SWAXS प्रणाली के तुलनात्मक प्रक्रिया कई प्रयोगात्मक विश्लेषण से निर्धारित किया जा चर के लिए अनुमति देता है. पैरामीटर है कि विश्लेषण से प्राप्त कर रहे हैं नमूना और प्रयोगात्मक सेटअप के अनुसार विभिन्न प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. SAXS नैनो पैमाने आकार और वस्तु के आकार के बारे में जानकारी प्रदान करता है है, जबकि WAXS परमाणु और सूक्ष्म पैमाने संरचना (जैसे आणविक जाली, इकाई कोशिका आयाम समरूपता) पर केंद्रित है. विशेष रूप से, पतला समाधान में कणों के लिए, SAXS परिचलन, कण आकार, आकार और की त्रिज्या का अध्ययन कर सकते हैं, उच्च घनत्व के नमूने के लिए, SAXS समाधान की संरचना का पहलू का अध्ययन कर सकते हैं, झरझरा यादृच्छिक / 2 चरण प्रणालियों के लिए, SAXS अध्ययन कर सकते हैं विशिष्ट भीतरी सतह और ताकना आकार, और तरल क्रिस्टलीय नमूने के लिए, WAXS जाली आयामों और इकाई कोशिका संरचना का अध्ययन कर सकते हैं. हालांकि, SWAXS की एक सीमा है कि की एक विस्तृत श्रृंखला कण आकार या polydispersity के वितरण गंभीर downgrप्रयोगात्मक परिणाम ADE.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
ग्राज़, आस्ट्रिया में ऑस्ट्रियन एकेडमी ऑफ साइंसेज में डा. Manfred Hecus XRS Kriechbaum और बायोफिज़िक्स और Nanosystems अनुसंधान के संस्थान का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. करूँगा और XW हिस्से में अमेरिका के ऊर्जा विभाग द्वारा समर्थित थे, नेरी - सी डे FG07-07ID14889 पुरस्कार नहीं है, और अमेरिकी परमाणु नियामक आयोग के तहत, सं NRC-38-08-950 पुरस्कार के तहत. अमेरिका के ऊर्जा विभाग द्वारा SWAXS साधन भी भाग में, सं डे NE0000325 पुरस्कार के तहत समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera | Hecus XRS and IBN, Graz, Austria |
||
| GNOM | ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg |
References
- Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
- Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
- Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
- Lysozyme in Water [Internet]. , Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
- Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. , Springer. Heidelberg. (2007).
- Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172 (1), 128 (2010).
- Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391 (7), 737 (2010).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
- Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27 (5-8), 1377-1381 (2007).
- Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357 (1), 88-94 (2011).
- Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27 (21), 6046-6054 (1994).
- Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).
