Summary
Демонстрация малого и широкий угол рассеяния рентгеновских лучей (SWAXS) процедура стала роль в изучении биологических макромолекул. Благодаря использованию приборов и процедур, специфических методов угол и подготовки, экспериментальные данные из SWAXS отображает атомного и нано-характеристика макромолекул.
Abstract
В этой статье малого и широкий угол рентгеновское рассеяние (SWAXS) анализ макромолекул продемонстрировал экспериментальным путем. SWAXS это техника, где Х-лучей упруго рассеянного неоднородного образца в нм-диапазона на малые углы (как правило, 0,1 - 5 °) и широкими углами (обычно> 5 °). Этот метод дает информацию о форме, размере и распределении макромолекулы, характерные расстояния частично упорядоченных материалов, размеров пор и поверхности к объему. Малый угол рентгеновского рассеяния (МУР) способен обеспечить структурную информацию макромолекул между 1 и 200 нм, в то время как широкий угол рентгеновское рассеяние (WAXS) может решить еще меньше брэгговских расстояние между образцами 0,33 нм и 0,49 нм на основе конкретные настройки системы и детектор. Расстояние определяется по закону Брэгга и зависит от длины волны и угла падения.
В эксперименте SWAXS, материалы могут быть твердымиили жидкой и может содержать твердых, жидких или газообразных области (так называемые частицы) того же или другого материала, в любой комбинации. SWAXS применения очень широк и включает коллоидов всех типов: металлы, композитные материалы, цемент, нефть, полимеры, пластмассы, белков, пищевых продуктов и лекарственных препаратов. Для твердых образцов, толщина ограничен примерно 5 мм.
Использование лаборатория контрольно-измерительных SWAXS подробно описано в этой статье. С доступного программного обеспечения (например, ГНОМ-ATSAS 2,3 пакета Д. Свергун EMBL-Гамбург и EasySWAXS программного обеспечения) для системы SWAXS, эксперимент может быть проведен для определения некоторых параметров, представляющих интерес для данного образца. Одним из примеров биологического эксперимента макромолекулы является анализ 2 мас лизоцима% в водной основе водного буфера, которые могут быть выбраны и подготовлены с помощью многочисленных методов. Подготовка образца следующим рекомендациям, указанным ниже в Подготовка образца раздел. Благодаря экспериментам SWAXS,важным структурным параметрам лизоцима, например, радиус инерции, могут быть проанализированы.
Protocol
1. Подготовка образца
- Используйте иглу для удаления некоторых образцов из образца контейнера *.
- Используйте иглу для заполнения капилляра (максимальный диаметр 2,2 мм) с образцом. Капиллярной должны быть заполнены между 2 и 3 см от дна.
- Закрыть капилляра плавления воска на кончик.
- Отвинтите держатель вакуумного образца из системы.
- Возьмите капилляр плавленого конца (воск конца) и вставить ООН, слившихся в конце держателя образца.
- Установите держатель обратно в систему и винт на место.
* Твердые образцы (в том числе порошковых образцах) могут быть непосредственно помещен в держатель образца (без капиллярной необходимости), в то время как жидкие образцы должны быть помещены в капилляр.
Запуск машины SWAXS
2. Источник холодного запуска процедуры
- Закройте затвор, нажав на кнопку спуска затвора безопасности.
- Включите основное питание"ON", нажав зеленую кнопку.
- Убедитесь, чрезвычайным "Shut-Off" кнопка находится в выдвинутом положении.
- Включите питание, нажав на зеленую кнопку.
- Убедитесь, что свет блокировка индикатор зеленый, с указанием всех блокировок в порядке.
- Подождите, пока сенсорный экран для загрузки. Как только он загружен, нажмите "R6" в меню.
- Поверните ключ ожидания на "ВКЛ".
- Поверните рентгеновского ключ к положение "ВКЛ". Красные рентгеновского излучения должен загореться.
- Подождите, сенсорный экран, чтобы читать ожидания уровня (30 кВ и 0,4 мА).
- Поверните ключ безопасности ожидания в положение "ВЫКЛ". Нажмите кнопку "Старт цикла" кнопки в нижней части сенсорного экрана.
- Подождите, сенсорный экран, чтобы читать номинальной мощности (50 кВ и 1 мА). Если другой уровень власти необходимо, введите конфигурация экрана, нажав "R4" на сенсорном экране и введите требуемые параметры.
3. Чиллер процедуры
- Включите питание SWIТКП в положение "ВКЛ" на панели управления температуры. Управление светом и светодиодный индикатор температуры загорится.
- Установите выключатель питания в положение "ВКЛ" на чиллер.
- Подождите, пока температура на дисплее "OFF". Это режим ожидания.
- Нажмите и удерживайте кнопку ввода (символ возврата) в течение примерно 4 секунд или до температуры дисплей показывает фактическую температуру.
- Чтобы изменить температуру, нажмите стрелку вверх или вниз. Установленное значение будет показано на дисплее температуры в течение примерно 8 секунд, прежде чем он вернется к фактической стоимости.
- Нажмите на кнопку один раз нужный набор значение. Это позволит сохранить это значение.
- Подождите, пока фактическая температура достигнет желаемого заданного значения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если в любой момент ошибки "E 01" появляется на табло температуры, следуйте инструкциям Chiller Shutdown, наполните ванну блока путем заливки очищенной воды в резервуар фильтрал, а затем выполнить процедуру запуска чиллера снова.
4. Остановка чиллера
- Нажмите кнопку "войти" в течение примерно 4 сек.
- Установите выключатель питания в положение "ВЫКЛ".
5. Включение вакуумного
- Убедитесь, что вакуум двери закреплены на месте.
- Включите вакуумный 1 и 2 ручки "ON" позиции.
- Подождите, пока VAP5 вакуумметра читает уровня вакуума менее 1,5 мбар.
6. Установка детектора системы
- Для настройки давления газа, проверка Главного избыточное давление редукционного клапана составляет не менее 10 бар.
- Откройте главный Valve.
- Медленно откройте клапан Рабочее давление, пока давление достигает 8 бар Манометр эксплуатации.
- Открытие Второго главного клапана
- Для регулировки потока газа, откройте главный клапан давления, повернув ручку в вертикальное положение на панели управления газ.
- Отрегулируйте потокСкорость с игольчатого клапана, пока манометр покажет около 8 бар.
- Поверните главный выключатель в положение "ВКЛ". Светодиодная лампа должна загораться.
- Для регулировки высокого напряжения, активизируют высокого напряжения, повернув переключатель в положение "ВКЛ". Светодиодная лампа должна загораться.
- Медленно поверните ручку контроля напряжения примерно до 3.5kV достигается на датчик. НЕ ПРЕВЫШАЕТ 4 кВ.
7. Калибровка
- Экспериментальные описанные выше действия выполняются с образцами известных пиков.
- ASA 3,3 используется для получения график интенсивности от канала с 5 вершинами.
- Выберите Меню → Настройки → Ввод каналов и соответствующей интенсивности.
- К ASA3, "ТПФ" на вкладке в первую очередь.
- Изменение фильтра, верхний левый 1 мм никель (луч фильтр).
- Установить позиции 32000 (диапазон 28000 до 32000, критическая область около 28000) → перейти к позиции, убедитесь, что вакуум ниже 5 мбар, убедитесь, что детектор причинамдинь между 1k-10К.
- Выполнить в течение 10 сек примерно 52 импульсов в секунду.
- Изменение энергии окна (или измерения энергии окно с образцом только, не включая фильтр случай). Установить финальный заезд на 10 сек.
- Найти место первичного пучка (канал 233 для примера).
- Для других трасс, изменить фильтр снова до 2 мм Вольфрам (W, ширина пробки) и начать с 30.000.
- Найти расположение всех других пиков образцов.
- Используйте ImageJ-макро программное обеспечение для калибровки SAXS - делает переходы от интенсивности по сравнению с канала на интенсивность по сравнению с Q (или расстояние D) (рис. 1).
- Используйте ImageJ-макро программное обеспечение для калибровки WAXS - делает переходы от интенсивности по сравнению с канала на интенсивность по сравнению с Q (или расстояние D) (рис. 2).
8. Программное обеспечение процедуры
- С помощью программного обеспечения ASA 3.3, для сбора данных в реальном времени: Live Data → TPF вкладку → Сохранить файл.
- Для EasySWAXS, нажмите на вкладку Параметры устройства.
- Введите "а", лямбда, и г ценностей, а также центр тяжести.
- Выбор точки Коллимация.
- Выберите шаровых типа частиц (если он не является, как известно, стержень плоской формы частиц).
- Нажмите на Гинье участки вкладки. Я против Q 2 график будет отображаться.
- Перетащите вертикальные линии, чтобы окружить части приблизительно линейной склона.
- В нижней части экрана, значение R будет отображаться. Рядом с этим есть проверка требований.
- Продолжайте перетаскивание вертикальные линии ближе друг к другу, пока проверка значение между 1 и 2. Это субъективное. Значение R, или радиус инерции, полученной оценкой.
9. Процедура Источник Shutdown
- Проверьте безопасность и быстрый ставни закрыты.
- Поверните ключ ожидания на "ВКЛ".
- Подождите, пока сенсорный читать ожидания уровней.
- Пресс R5 на тouchscreen.
- Уменьшите ток 0 A.
- Снижение напряжения до 0 А.
- Поверните рентгеновского ключ к положение "ВЫКЛ".
- Включите основное питание "OFF", нажав на красную кнопку выключения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SAXS и WAXS в целом может обеспечить структурную информацию образца с помощью следующих параметров: радиус инерции, размер и форма частиц, коэффициент структуры решения, конкретные внутренней поверхности и размера пор, решетка типа и размера, а также электронная плотность 1. SAXS и WAXS также может быть применен к изучению динамики белков 2.
Структурной информации SWAXS экспериментов получены путем сравнения экспериментально обнаружены спектры и результаты расчетов системы. Результаты расчетов были рассчитаны в программном обеспечении с разумной эффективный потенциал V эфф (г) разработан на статистических моделях механики, такие как Орнштейна-Цернике (ОЦ) интегрального уравнения теории (пример такого анализа можно видеть из работы. 3) .
В рамках анализа данных методов, моделей для SWAXS абсолютной интенсивности I (Q) должны быть разработаны в программное обеспечение для исследования, где интенсивность рассеяния, I (Q), есть функция передачи импульса в обратном пространстве, вектора рассеяния Q = 4π грех (θ / 2) / λ. д скалярная величина, которая соединена с угла рассеяния θ, а длина волны излучения, λ. Вопрос лежит в диапазоне от 0,03 - 0,6 Å -1 в типичном эксперименте SAXS с выбранным образцом и детектором расстояния. Размер области исследованы в реальном пространстве связана с д г = 2π / д, и лежит в диапазоне 11-2000 A 4. WAXS, с другой стороны, может решить расстояние больше чем 3,3 Å. I (Q) зависит от атомного функции и положение атомных центров рассеяния. В SWAXS эксперимент, в первую измеряемой интенсивности по сравнению канал должен быть откалиброван для интенсивности от расстояния д или D (рис. 1 и Пример SAXS анализ лизоцима в 2% мас водной основе водного буфера показано на рисунке 3. Значение радиуса инерции получен и показано на рисунке 3 сравнивается приятно, чтобы ожидаемое значение около 1,44 нм 5. Вот еще примеры того, как применять SAXS биологических макромолекул могут быть найдены из работ. 6-13. Пример WAXS анализ липосомы, диспергированных в водном растворе показано на рисунке 4. Равноотстоящих пиков уменьшается с ростом д, придает липосомы в воде на основе водного раствора образца в слоистой структурой. С каждой ламели, происходит уменьшение в рассеянии, что будет происходить. 
Рисунок 1. Калибровка SAXS с ImageJ-макро программное обеспечение. Образце используется серебро Стеарат с расстоянием г 48,68 Å. Первичного пучка находится на канале 367 и пять основных пиков (или параметров решетки образца) расположены в 539, 717, 896, 1075, и 1253 каналов, соответственно. 
Рисунок 2. WAXS-Callibration с ImageJ-макро программное обеспечение. Образце используется Para-бром бензойная кислота порошок. Шесть основных пиков (или параметров решетки образца) расположен в 130, 484, 555, 613, 657, и 902 каналов, соответственно. 
Рисунок 3. Фон-вычитают SAXS необработанных данных лизоцима (2% по массе). Гинье-сюжет из программы EasySWAXS может использовать очень низкие д 
Рисунок 4. Фон-вычитают WAXS необработанных данных липосом, диспергированных в водной основе водного раствора показана на рисунке 4а. СХЕМЫ структуру липосомы (1D пластинчатые), его гидрофильных и гидрофобных головы хвоста, его фосфолипидных мембран стек, и его функция плотности электронов показаны на рисунке 4В. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сравнительный порядок системы SWAXS позволяет многочисленными переменными, которые будут определены по экспериментальным анализом. Параметров, которые достигаются в результате анализа могут быть использованы для различных целей, в соответствии с образцом и экспериментальной установки. SAXS предоставляет информацию о нано-размера и формы объекта, в то время как WAXS фокусируется на атомном и микро-масштабе структуры (например, молекулярные решетки, ячейки измерения симметрии). В частности, для частиц в разбавленных растворах, SAXS можно изучать радиус инерции, размер частиц, и формы; высокой плотности образцов, SAXS может изучить структурный фактор раствора; для случайных пористых / 2 фазной системы, SAXS можно изучать конкретной внутренней поверхности и размера пор, а для жидкокристаллических образцов, WAXS могут изучать решетки размерами и структурой элементарной ячейки. Тем не менее, ограничение SWAXS в том, что широкий спектр распределения частиц по размерам или полидисперсность будет серьезно downgrADE экспериментальных результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-р Манфред Kriechbaum из XRS Hecus и Института биофизики и наносистем исследований Австрийской академии наук в Граце, Австрия. LL и XW была частично поддержана Министерством энергетики США, под NERI-C решение № DE-FG07-07ID14889 и США Комиссия по ядерному регулированию, под решение № СРН-38-08-950. Прибор SWAXS также при частичной поддержке Министерства энергетики США, под решение № DE-NE0000325.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The System3 Small- and Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Camera | Hecus XRS and IBN, Graz, Austria |
||
| GNOM | ATSAS 2.3 package by D. Svergun EMBL-Hamburg |
References
- Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
- Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
- Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
- Lysozyme in Water [Internet]. , Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
- Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. , Springer. Heidelberg. (2007).
- Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172 (1), 128 (2010).
- Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391 (7), 737 (2010).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
- Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27 (5-8), 1377-1381 (2007).
- Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357 (1), 88-94 (2011).
- Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27 (21), 6046-6054 (1994).
- Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).
