在本研究中报道的新颖协议在小鼠经合并在单细胞分辨率允许选择性检测肺转移<em>在原位</em>肺灌注固定和X-Gal染色<em> lacZ的</em>标记的肿瘤细胞。
转移是主要死亡原因,在大多数类型的癌症,因此在癌症研究的一个主要焦点。然而,影像学和成功在他们的治疗消灭微小转移灶的检测仍然是有限的。
尽管动物模型已经被证明是非常宝贵的工具,用于癌症研究1,监视/微转移灶的可视化仍然是一个挑战和不准确的评价转移扩散的临床前研究,可能导致令人失望的结果在临床试验中2。因此,有极大的兴趣,在改进的方法,最终使重现性好,可靠的检测在正常组织中单个细胞水平上的转移。因此,主要的重点是对技术,它允许在体内的肿瘤细胞的检测,如微计算机断层扫描(微CT),正电子发射断层扫描(PET),生物发光或荧光成像<SUP> 3,4。目前,我们正在优化这些技术在原发肿瘤的生长和转移在不同的骨肉瘤模型体内监测。其中的一些技术也可以用于体外分析转移旁边类似的qPCR 5,流式细胞仪6或不同类型的组织学染色的经典方法。为基准,在本研究中,我们已经建立的稳定转染或转导的肿瘤细胞与 lacZ基因编码细菌的酶β-半乳糖苷酶代谢的显色底物5 -溴-4 -氯-3 -吲哚基-β-D -吡喃半乳糖苷(X-Gal的)一种不溶性靛兰染料7和允许高灵敏度和选择性的组织化学蓝染色的肿瘤细胞在小鼠组织体外单细胞水平,如下所示。这是一个低成本,而不是大量设备的工具,它允许转移8在研究的精确验证评估新ticancer疗法9-11。 X-gal染色的一个限制因素是低的对比度,以及血管化组织, 例如血液相关的红色染色。在肺组织中,这个问题是可以解决的原位灌注肺,Borsig 等12灌注小鼠的肺部麻醉下,他们从血液中清除,修复和嵌入在原地 ,这是最近成立的一个技术通过气管通胀。此方法可以防止肺崩溃,从而保持形态的功能,肺泡,从而提高了质量的组织进行组织学分析。在本研究中,我们描述了一种新的协议,它充分利用了X-gal染色的 lacZ表达的肿瘤细胞的结合, 在原位灌注,肺组织固定。这家精致的协议允许高灵敏度检测的细胞在肺单发转移,使我们在最近的研究为detect“冬眠”肺微转移的小鼠模型13,原本是描述非转移性14。
这里提出的结果,在Dunn/LM8鼠标操作系统模型展示的力量,新成立的方法,它结合了X-Gal染色LacZ基因标记的肿瘤细胞的原位灌注/肺组织固定。这两种技术的组合允许微转移病灶的高灵敏度检测到单细胞水平,也提高了肺表面( 图1),以及在肺部( 图2)上的可视化的巨转移。虽然在X-Gal染色也允许在其他器官, 原位灌注/固定的(微)转移的检测因为天然的血液和组织相关的颜色只是略有改善肺以外的组织中转移灶的可探测性这些器官13。即使灌注被定向到另一个器官, 例如肝脏,除去血液中仅部分地改善下注的对比度之间的X-Gal染色的天然颜色的器官。然而,该方法适用于任何类型的LacZ基因标记的肿瘤细胞,将显着改善的可探测性肺转移的电平下降到休眠状态的单细胞微转移,使宏观和微转移的一个简单的和可靠的定量。这种方法的一个限制是基于报告基因,包括荧光素酶和荧光蛋白质,和所有其他技术的转基因表达的稳定性。如在图2d所示,不是所有的肿瘤细胞内的macrometastatic灶被染成蓝色,表示缺乏β-半乳糖苷酶的活性。这可能是坏死,但它更可能是由于转基因表达的亏损。我们观察到,邓恩和LM8细胞中的表达lacZ和其他转基因的下调,即使在连续选择是非常有效的。因此,我们在近期的研究中切换到小鼠K12和K7M2和人力居屋,143B和SAOS-2骨肉瘤细胞株,都保持稳定的lacZ的表达在体外以及体内高达100%,随着时间的推移。
一旦保证稳定的lacZ的表达,这种技术可应用于研究基因操作的肿瘤细胞中, 例如 ,机械地调查过程中组织定植13以及用于开发和测试的新的治疗方法,旨在消除转移病灶15 ,16。此外,它可以作为一个基准放射成像技术,如PET,(微)CT和MRI,用于早期发现转移病灶的改善。在最近的PET研究(未出版),不同的示踪剂,我们验证在体内检测到肺转移随后的体外所描述的协议。在一个新的小动物微型CT(SKYSCAN)正在进行的研究是迄今为止AB文件在体内检测肺转移到的尺寸为0.5毫米,下降到0.3毫米的体外 ,但我们的目标是在一个分辨率为0.1毫米。有趣的是,这是宏观微转移的原位灌注,X-Gal染色相结合的方法,我们区分大小的限制。这再次彰显这个简单的和具有成本效益的技术的敏感性和有效性。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢他的意见,博士,Borsig Lubor(生理研究所,瑞士苏黎世大学)为肺灌注技术。这项工作是支持的Krebsliga的Kanton苏黎世,沃尔特·沃尔夫基金会和Johanna,苏黎世,的莉迪亚Hochstrasser基金会,苏黎世,瑞士国家科学基金会,SNF,瑞士法律组成的社团性质的Balgrist Schweizerischer,大学和补助苏黎世。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
Nuclear-Fast Red – Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 |
Table 1. Reagents and Equipment.