Romanen protokollen rapportert i denne studien kan selektiv påvisning av lungemetastaser ved enkelt celle oppløsning i mus ved kombinerte<em> In-situ</em> Lunge perfusjon og fiksering og X-Gal farging av<em> LacZ</em>-Merket tumorceller.
Metastasering er den viktigste dødsårsaken i de fleste krefttyper og dermed et hovedfokus i kreftforskning. Imidlertid, påvisning av micrometastases etter radiologiske bildebehandling og suksessen i deres terapeutiske utrydding forblir begrenset.
Mens dyremodeller har vist seg å være uvurderlig verktøy for kreftforskning 1, forblir overvåking / visualisering av micrometastases en utfordring og unøyaktig vurdering av metastatisk spredning i prekliniske studier potensielt fører til skuffende resultater i kliniske studier 2. Følgelig er det stor interesse i raffinering metodene å endelig tillate reproduserbare og pålitelig deteksjon av metastaser ned til enkelt celle nivå i normalt vev. Hovedfokus er derfor på teknikker, som tillater påvisning av kreftceller in vivo, som mikro-CT (micro-CT), positronemisjonstomografi (PET), Bioluminescens eller fluorescens bildebehandling <sup> 3,4. Vi er for tiden å optimalisere disse teknikkene for in vivo overvåking av primærtumor vekst og metastasering i ulike osteosarkom modeller. Noen av disse teknikkene kan også brukes for ex vivo analyse av metastasering ved klassiske metoder som 5 qPCR, FACS 6 eller ulike typer histologisk farging. Som en målestokk, har vi etablert i den foreliggende studie var stabile transfeksjon eller transduksjon av tumorceller med lacZ-genet som koder for bakteriell enzymet β-galaktosidase som metabolizes det kromogene substrat 5-brom-4-klor-3-indolyl-beta-D -galaktopyranosid (X-Gal) til en uløselig indigo blå fargestoff 7 og tillater svært følsom og selektiv histochemical blå farging av tumorceller i mus vev ex vivo ned til enkelt celle nivå som vist her. Dette er en lav-kost og ikke utstyr-intensive verktøyet, som lar presis validering av metastaser 8 i studier vurdere nye enticancer terapi 9-11. En begrensende faktor på X-gal farging er lav kontrast til f.eks blodrelaterte røde farging av brønn vaskularisert vev. I lungevev dette problemet kan løses ved in-situ lunge perfusjon, en teknikk som nylig ble etablert av Borsig et al. 12 som perfused lungene av mus under narkose for å fjerne dem fra blod og å fikse og legge dem in-situ i henhold inflasjonen gjennom luftrøret. Denne metoden forhindrer også sammenbruddet av lungen og derved opprettholder morfologien av funksjonelle lunge alveoler, som forbedrer kvaliteten av vevet for histologisk analyse. I foreliggende studie, beskriver vi en ny protokoll, som utnytter en kombinasjon av X-gal farging av lacZ-uttrykkende tumorceller og in-situ perfusjon og fiksering av lungevev. Denne raffinerte protokollen gir høy følsomhet deteksjon av enkle metastatisk celler i lungene og aktivert oss i en fersk undersøkelse for å detect "hvilende" lunge micrometastases i en mus modell 13, som opprinnelig ble beskrevet å være ikke-metastatisk 14.
De her presenteres resultater i Dunn/LM8 mus OS modell demonstrere makt den nyopprettede metode som kombinerer X-Gal farging av lacZ-merket tumorceller med in-situ perfusjon / fiksering av lungevev. Denne kombinasjonen av de to teknikkene gir høy følsomhet påvisning av micrometastatic lesjoner ned til enkelt celle nivå og også forbedrer visualiseringen av macrometastases på lunge overflaten (figur 1), så vel som i lunge seksjoner (figur 2). Mens X-Gal farging tillater også påvisning av (mikro) metastaser i andre organer, in-situ perfusjon / fiksering forbedrer oppdagbarhet av metastatisk foci i vev enn lungen bare litt på grunn av den naturlig blod-og vev-relaterte farge av disse organene 13. Selv om perfusjon er rettet mot et annet organ, f.eks leveren, ville fjernelse av blodet bare delvis forbedre kontrasten innsatsenWeen X-Gal flekker og den naturlige fargen på orgel. Imidlertid er metoden anvendelig for alle typer lacZ-merkede tumorceller, vil dramatisk forbedre oppdagbarhet av lunge metastasering ned til nivået av sovende encellede micrometastases og muliggjør en enkel og pålitelig kvantifisering av makro-og micrometastases. En begrensning av denne metoden, og alle andre teknikker som er basert på rapportørgrupper gener, inkludert luciferase og fluorescerende proteiner, er stabiliteten av transgenet uttrykket. Som vist i figur 2d, er ikke alle tumorceller innenfor macrometastatic foci blåfarget, som indikerer fravær av beta-galaktosidase-aktivitet. Dette kan være relatert til nekrose, men det er mer sannsynlig på grunn av tap av transgene uttrykk. Vi observerte at Dunn og LM8 celler er svært effektive i nedregulering av lacZ og andre transgener selv under kontinuerlig utvalg for uttrykk. Vi har derfor slått i nyere studier til murine K12og K7M2 og de menneskelige HOS, 143b og SaOS-2 osteosarkom cellelinjer, som alle opprettholdes stabil lacZ ekspresjon in vitro, så vel som in vivo opp til 100% over tid.
Når stabil lacZ-uttrykk er garantert, kan denne teknikken brukes i studier med gen-manipulerte tumorceller, f.eks til mekanistisk undersøke prosessen med vev kolonisering 13, samt for utvikling og testing av nye behandlingsformer med sikte på utryddelse av metastatisk lesjoner 15 , 16 år. Videre kan det tjene som en målestokk for forbedring av dagens radiologiske imaging teknikker, for eksempel PET, (micro) CT og MR, som brukes for tidlig deteksjon av metastatisk lesjoner. I en nylig undersøkelse PET (upublisert) med forskjellige tracere verifisert vi in vivo detektert lungemetastaser senere ex vivo med den beskrevne protokoll. I en pågående studie med en ny liten dyr mikro-CT (SkyScan) vi er så langt able for å oppdage lungemetastaser i vivo ned til en størrelse på 0,5 mm og ex vivo ned til 0,3 mm, men vi sikte på en oppløsning på 0,1 mm. Interessant nok er denne størrelsen grensen som vi satt å skille makro-fra micrometastases med den kombinerte metode in-situ perfusjon og X-Gal farging. Dette understreker igjen følsomheten og nytten av denne enkle og kostnadseffektive teknikk.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke dr. Lubor Borsig (Institute of Physiology, University of Zurich) om hans råd om teknikken av lunge perfusjon. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Krebsliga av Kanton Zürich, Walter L. og Johanna Wolf Foundation, Zürich, Lydia Hochstrasser Foundation, Zürich, den sveitsiske National Science Foundation, SNF, Sveits, Schweizerischer Verein Balgrist, og universitetet av Zürich.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
Nuclear-Fast Red – Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 |
Table 1. Reagents and Equipment.