उपन्यास वर्तमान अध्ययन में रिपोर्ट प्रोटोकॉल संयुक्त द्वारा चूहों में एकल कक्ष संकल्प पर फेफड़ों metastases के चुनिंदा पता लगाने की अनुमति देता है<em> में सीटू</em> फेफड़ों के छिड़काव और निर्धारण और एक्स – लड़की का धुंधला हो जाना<em> LacZ</emट्यूमर कोशिकाओं> टैग.
Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme β-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect “dormant” lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.
Dunn/LM8 माउस ओएस मॉडल में यहाँ प्रस्तुत परिणाम नव स्थापित विधि कि छिड़काव में सीटू / फेफड़े के ऊतकों के निर्धारण के साथ lacZ टैग ट्यूमर कोशिकाओं के एक्स – लड़की धुंधला हो को जोड़ती की शक्ति को प्रदर्शित करता है. दो तकनीकों का यह संयोजन micrometastatic घावों की उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने के एकल कोशिका के स्तर को नीचे की अनुमति देता है और भी फेफड़ों सतह (चित्रा 1) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फेफड़ों के वर्गों में (2 चित्रा) पर macrometastases दृश्य में सुधार. जबकि धुंधला हो एक्स – लड़की भी रक्त और ऊतक से संबंधित प्राकृतिक रंग की वजह से अन्य अंगों में सीटू छिड़काव / निर्धारण में metastases (माइक्रो) का पता लगाने की अनुमति देता है फेफड़ों के अलावा अन्य ऊतकों में metastatic foci के detectability केवल थोड़ा में सुधार इन 13 अंगों की. यहां तक कि अगर छिड़काव अन्य अंगों को निर्देश दिया है, जिगर जैसे, खून की केवल आंशिक रूप से हटाने के विपरीत शर्त में सुधार होगासमझना एक्स लड़की धुंधला हो जाना और अंग के प्राकृतिक रंग. हालांकि, विधि lacZ टैग ट्यूमर कोशिकाओं के किसी भी प्रकार के लिए लागू होता है, नाटकीय रूप से फेफड़ों मेटास्टेसिस के detectability में सुधार नीचे निष्क्रिय एकल कोशिका micrometastases के स्तर और मैक्रो और micrometastases के एक आसान और विश्वसनीय मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है. इस विधि और सभी अन्य तकनीकों कि luciferase और फ्लोरोसेंट प्रोटीन सहित रिपोर्टर जीन, के आधार पर कर रहे हैं की एक सीमा transgene अभिव्यक्ति की स्थिरता है. जैसा कि चित्र 2d में दिखाया है, macrometastatic foci के भीतर ट्यूमर नहीं सभी कोशिकाओं नीले दाग रहे हैं, बीटा galactosidase गतिविधि की एक कमी का संकेत है. यह परिगलन से संबंधित हो सकता है, लेकिन यह अधिक संभावना है transgene अभिव्यक्ति का एक नुकसान के कारण है. हमने पाया है कि डन और LM8 कोशिकाओं लगातार चयन के तहत भी lacZ और अन्य transgenes की अभिव्यक्ति के लिए नीचे विनियमन में बहुत प्रभावी रहे हैं. इसलिए हम हाल ही के अध्ययन में murine K12 बंदऔर K7M2 और मानव अस्पताल 143B, और SaOS-2 ऑस्टियो सार्कोमा सेल लाइनों, जो सभी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समय पर 100% करने के लिए vivo में इन विट्रो में स्थिर lacZ अभिव्यक्ति बनाए रखा.
एक बार स्थिर lacZ अभिव्यक्ति की गारंटी है, इस तकनीक जीन चालाकी से ट्यूमर कोशिकाओं, mechanistically ऊतक 13 उपनिवेश की स्थापना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विकास और नए उपचारों का परीक्षण metastatic 15 घावों के उन्मूलन में लक्ष्य के लिए करने की प्रक्रिया की जांच करने के लिए जैसे के साथ पढ़ाई में लागू किया जा सकता है 16. इसके अलावा, यह पीईटी, सीटी (माइक्रो) और एमआरआई जैसे वर्तमान रेडियोलॉजिकल इमेजिंग तकनीक, metastatic घावों का जल्दी पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता के सुधार के लिए एक बेंचमार्क के रूप में सेवा कर सकते हैं. हम अलग tracers के साथ हाल ही में एक पीईटी अध्ययन (अप्रकाशित) में सत्यापित vivo का पता चला फेफड़ों में वर्णित प्रोटोकॉल के साथ बाद में पूर्व vivo metastases. (SkyScan) एक नए छोटे पशु सूक्ष्म सीटी के साथ चल रहे एक अध्ययन में हम इतनी दूर कर रहे हैं अबvivo में ले फेफड़ों metastases का पता लगाने के लिए नीचे 0.5 मिमी और पूर्व vivo 0.3 मिमी के लिए नीचे के आकार के लिए, लेकिन हम 0.1 मिमी के एक प्रस्ताव पर करना है. दिलचस्प है, यह आकार की सीमा है कि हम में सीटू छिड़काव और धुंधला हो एक्स – लड़की के संयुक्त विधि के साथ micrometastases मैक्रो से अलग करने के लिए सेट है. यह फिर से और यह आसान और लागत प्रभावी तकनीक की संवेदनशीलता उपयोगिता को रेखांकित करता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों के लिए उनकी सलाह के लिए फेफड़ों के छिड़काव की तकनीक पर डॉ. Lubor Borsig (फिजियोलॉजी संस्थान, विश्वविद्यालय के ज्यूरिख) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. यह काम Kanton ज्यूरिख के Krebsliga, वाल्टर एल और जोहन्ना भेड़िया फाउंडेशन, ज्यूरिख, लिडा Hochstrasser फाउंडेशन, ज्यूरिख, स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, एसएनएफ, स्विट्जरलैंड, Schweizerischer Verein Balgrist, और विश्वविद्यालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया ज्यूरिख के.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
Nuclear-Fast Red – Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 |
Table 1. Reagents and Equipment.