Il nuovo protocollo riportato nel presente studio permette la rilevazione selettiva delle metastasi polmonari con una risoluzione singola cellula nei topi combinata<em> In-situ</em> Perfusione polmonare e la fissazione e colorazione X-Gal di<em> LacZ</em>-Tagged cellule tumorali.
Metastasi è la principale causa di morte nella maggior parte dei tipi di cancro e di conseguenza un obiettivo principale nella ricerca sul cancro. Tuttavia, il rilevamento di micrometastasi di immagini radiologica e il successo nella loro eradicazione terapeutico rimangono limitate.
Mentre modelli animali hanno dimostrato di essere strumenti preziosi per la ricerca sul cancro 1, il controllo / visualizzazione di micrometastasi rimane una sfida e una valutazione imprecisa di diffusione metastatica in studi preclinici porta potenzialmente a risultati deludenti negli studi clinici 2. Di conseguenza, vi è un grande interesse per affinare i metodi per consentire finalmente rilevamento riproducibile e affidabile di metastasi al livello di singola cellula nel tessuto normale. L'obiettivo principale è quindi sulle tecniche, che consentono l'individuazione delle cellule tumorali in vivo, come la micro-tomografia computerizzata (micro-CT), la tomografia ad emissione di positroni (PET), bioluminescenza o imaging di fluorescenza <sup> 3,4. Attualmente stiamo ottimizzando queste tecniche per il monitoraggio in vivo della crescita tumorale primario e metastasi in modelli diversi osteosarcoma. Alcune di queste tecniche può essere utilizzato anche per l'analisi ex vivo di metastasi accanto metodi classici come qPCR 5, 6 o FACS diversi tipi di colorazione istologica. Come valore di riferimento, abbiamo stabilito nel presente studio la trasfezione stabile o trasduzione di cellule tumorali con il gene lacZ codifica l'enzima batterico β-galattosidasi che metabolizza il substrato cromogeno 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D -galattopiranoside (X-Gal) in un colorante blu insolubile indaco 7 e permette altamente sensibile e selettivo colorazione istochimica blu di cellule tumorali in vivo ex tessuti mouse per livello di singola cellula, come qui mostrato. Questo è uno strumento a basso costo e non attrezzature ad alta intensità, che consente la validazione precisa di metastasi 8 in studi di valutazione di un nuovoterapie ticancer 9-11. Un fattore limitante di X-gal colorazione è il basso contrasto, ad esempio, consanguinei colorazione rosso di ben tessuti vascolarizzati. In tessuto polmonare questo problema può essere risolto in situ perfusione polmonare, una tecnica che è stata recentemente istituita dal Borsig et al. Perfusi 12 anni che i polmoni di topi in anestesia per eliminarli dal sangue e per fissare e incorporarli in situ sotto inflazione attraverso la trachea. Questo metodo impedisce anche il collasso del polmone e mantiene quindi la morfologia funzionale alveoli polmonari, che migliora la qualità del tessuto per l'analisi istologica. Nel presente studio, si descrive un nuovo protocollo, che sfrutta una combinazione di X-gal colorazione lacZ cellule tumorali che esprimono e in-situ perfusione e fissazione del tessuto polmonare. Questo protocollo permette raffinato alta sensibilità di rilevazione di singole cellule metastatiche nel polmone e permesso in un recente studio di detect "dormienti" micrometastasi polmonari in un modello murino 13, che è stato originariamente descritto di essere non-metastatico 14.
I risultati qui presentati nel modello di topo Dunn/LM8 OS dimostrare la potenza del metodo appena stabilito che combina l'X-Gal colorazione lacZ-etichetta cellule tumorali con l'in-situ perfusione / fissaggio del tessuto polmonare. Questa combinazione delle due tecniche permette la rilevazione elevata sensibilità di lesioni micrometastatica fino a livello di singola cellula e migliora anche la visualizzazione macrometastasi sulla superficie polmonare (Figura 1) e in sezioni polmonari (Figura 2). Mentre l'X-Gal colorazione permette inoltre la rilevazione di (micro) metastasi in altri organi, in-situ perfusione / fissazione migliora la rilevabilità di foci metastatici in tessuti diversi dal polmone solo leggermente a causa del colore naturale sangue e tessuti correlati di questi organi 13. Anche se la perfusione è diretta ad un altro organo, ad esempio il fegato, la rimozione del sangue potrebbe migliorare solo parzialmente dal contrastoween X-Gal colorazione e il colore naturale dell'organo. Tuttavia, il metodo è applicabile a qualsiasi tipo di etichetta lacZ-cellule tumorali, migliorare notevolmente la rilevabilità di metastasi polmonari fino al livello di dormienti monocellulari micrometastasi e consente una quantificazione semplice e affidabile di macro e micrometastasi. Un limite di questo metodo e tutte le altre tecniche che si basano su geni reporter luciferasi, comprese le proteine fluorescenti, e la stabilità del transgene. Come mostrato in figura 2d, non tutte le cellule tumorali all'interno foci macrometastatic sono di colore blu, che indica una mancanza di beta-galattosidasi. Questo potrebbe essere correlato a necrosi, ma è più probabilmente dovuta ad una perdita di espressione del transgene. Abbiamo osservato che il Dunn e LM8 cellule sono molto efficaci nel down-regulation di lacZ e transgeni altri anche in continua selezione per l'espressione. Abbiamo quindi commutata in studi recenti per l'murine K12e K7M2 e gli umani HOS, 143B e SaOS-2 linee cellulari di osteosarcoma, tutte mantenute stabili lacZ espressione in vitro e in vivo fino al 100% nel tempo.
Una volta stabile lacZ-espressione è garantita, questa tecnica può essere applicata in studi con gene-manipolati cellule tumorali, per esempio per investigare meccanicamente il processo di colonizzazione tessuto 13 e per lo sviluppo e la sperimentazione di nuove terapie obiettivo di eradicazione delle lesioni metastatiche 15 , 16. Inoltre, può servire come punto di riferimento per il miglioramento delle attuali tecniche di imaging radiologici, come la PET, (micro) TC e RM, utilizzati per la diagnosi precoce delle lesioni metastatiche. In uno studio PET recente (inedito) con traccianti diversi abbiamo verificato in vivo polmone rilevato metastasi ex vivo successivamente con il protocollo descritto. In uno studio in corso con un nuovo animale piccolo micro-CT (SkyScan) siamo così lontani abper rilevare le metastasi polmonari in vivo fino ad una dimensione di 0,5 mm ed ex vivo fino a 0,3 mm, ma relative ad una risoluzione di 0,1 mm. Curiosamente, questo è il limite che abbiamo impostato per distinguere macro-di micrometastasi con il metodo combinato di perfusione in situ e X-Gal colorazione. Questo sottolinea ancora una volta la sensibilità e l'utilità di questa tecnica semplice e conveniente.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Lubor Borsig (Istituto di Fisiologia, Università di Zurigo) per i suoi consigli sulla tecnica della perfusione polmonare. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal Krebsliga del Cantone di Zurigo, la L. Walter e Johanna Wolf Foundation, Zurigo, il Lydia Hochstrasser Foundation, Zurigo, il Fondo nazionale svizzero, SNF, Svizzera, Schweizerischer Verein Balgrist, e l'Università di Zurigo.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
Nuclear-Fast Red – Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 |
Table 1. Reagents and Equipment.