Bu çalışmada bildirilen yeni protokol kombine farelerde tek hücreli çözünürlükte metastaz seçici algılama sağlar<em> In-situ</em> Akciğer perfüzyon ve fiksasyon ve X-Gal boyama<em> LacZ</emTümör hücreleri> etiketli.
Metastaz kanser türlerinin çoğunda başlıca ölüm nedeni ve kanser araştırma, dolayısıyla bir ana odak noktasıdır. Ancak, radyolojik görüntüleme ve tedavi eradikasyon başarısı ile mikrometastaz tespit sınırlı kalır.
Hayvan modellerinde kanser araştırma 1 için çok değerli araçlar olduğu kanıtlanmış olsa da, izleme / mikrometastazlar görselleştirme preklinik çalışmalarda bir meydan okuma ve metastatik yayılım eksik değerlendirilmesi potansiyel klinik çalışmalarda 2 hayal kırıklığı yaratan sonuçlar yol açar kalır. Sonuç olarak, nihayet normal dokuda tek hücre düzeyinde metastaz tekrarlanabilir ve güvenilir algılama sağlamak için metodlarla rafine büyük ilgi var. Ana odak nedenle mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT), pozitron emisyon tomografisi (PET), biyolüminesans veya floresan görüntüleme gibi in vivo tümör hücrelerinin algılanmasına izin teknikleri üzerinde <> 3,4 sup. Biz şu anda farklı osteosarkom modelleri primer tümör büyümesi ve metastaz vivo izlenmesi için bu teknikleri optimize edilmiştir. Bu tekniklerin bazıları qPCR 5, 6 ya da FACS histolojik boyama farklı türleri gibi klasik yöntemlerin yanında metastaz ex vivo analiz için de kullanılabilir. Bir kriter olarak, kararlı transfeksiyon veya lacZ geni ile tümör hücrelerinin transdüksiyonu bakteriyel bir enzim kromojenik substrat 5-bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D metabolize β-galaktosidaz kodlayan bu çalışmada kurduk çözülmeyen bir indigo mavisi 7 ve burada gösterildiği gibi tek hücre düzeyinde fare doku ex vivo olarak tümör hücrelerinin son derece hassas ve seçici histokimyasal mavisi boyama aşağı izin verir-galactopyranoside (X-Gal). Bu çalışmalarda metastaz 8 hassas doğrulama bir yeni değerlendirmede olanak sağlayan düşük maliyetli ve ekipman yoğun değil araçtırticancer tedaviler 9-11. X-gal boyası bir sınırlayıcı faktör de vaskülarize dokuların kan ile ilgili kırmızı boyama, örneğin düşük kontrast olduğunu. Akciğer dokusunda bu sorunu yerinde akciğer perfüzyon, son zamanlarda Borsig ark. 12. Kan bunları temizlemek için ve altında in-situ bunları düzeltmek ve gömmek için anestezi altında farelerin akciğerlerinde perfüze tarafından kurulmuş bir teknik ile çözülebilir trakea yoluyla enflasyon. Bu yöntem aynı zamanda akciğer çökmesi önler ve böylece histolojik analiz için doku kalitesini geliştirmektedir fonksiyonel akciğer alveol, morfolojisini muhafaza eder. Bu çalışmada, biz lacZ eksprese tümör hücrelerinin X-gal boyası bir arada yararlanır ve in-situ perfüzyon ve akciğer doku fiksasyonu., Yeni bir protokol, tarif Bu rafine protokol akciğerde tek metastatik hücrelerinin yüksek hassasiyet algılama sağlar ve d yeni bir çalışmada bize etkinBaşlangıçta 14 sigara metastatik olduğu açıklanan bir fare modeli 13 yılında "atıl" akciğer mikrometastazlar etect.
Dunn/LM8 fare modelinde OS burada sunulan sonuçlar, in-situ perfüzyon / akciğer dokusunda tespit lacZ ile etiketlenmiş tümör hücreleri X-gal boyaması birleştiren yeni kurulan yöntem gücünü göstermektedir. İki tekniğin bu kombinasyonu tek bir hücre düzeyinde mikrometastazların lezyonların yüksek duyarlılık tespit aşağı izin verir ve aynı zamanda akciğer yüzey (Şekil 1) hem de akciğer bölümler halinde (Şekil 2) üzerindeki macrometastases bir görüntüleme artırır. X-Gal boyama da çünkü doğal kan ve doku ile ilgili renk diğer organları, in-situ perfüzyon / fiksasyonu (mikro) metastaz tespiti sadece biraz akciğer dışındaki dokularda metastatik odaklar tanımlanabilirliğini geliştirir sağlarken Bu organların 13. Başka bir organ perfüzyon yönlendirilir bile, karaciğer, örneğin, kan kaldırılması sadece kısmen kontrast bahsi artıracakween X-Gal boyama ve organ doğal rengi. Bununla birlikte, yöntem lacZ-etiketli tümör hücrelerinin her türü için geçerli olduğu, önemli ölçüde hareketsiz tek hücreli mikrometastazların seviyesine akciğer metastazı tanımlanabilirliğini arttırmak aşağı ve makro ve mikrometastazların bir miktarı kolay ve güvenilir bir miktar sağlar olacaktır. Bu yöntem ve lusiferaz ve floresan proteinleri içeren muhabiri genleri, dayalı tüm diğer tekniklerin bir sınırlama transgen ifade istikrardır. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, macrometastatic odakları içindeki tüm tümör hücreleri beta-galaktosidaz aktivitesi eksikliği gösteren mavi lekeli. Bu nekroz ile ilgili olabilir, ama daha büyük olasılıkla transgen ekspresyonu kaybı nedeniyle. Biz Dunn ve LM8 hücreleri ifade için bile sürekli seçilim altında lacZ ve diğer transgenlerin down-regülasyonu çok etkili olduğu görülmektedir. Bu nedenle fare K12 için son yıllarda yapılan çalışmalarda açıkve K7M2 ve bütün in vitro hem de yukarı saat boyunca% 100 in vivo kararlı lacZ ekspresyonu yapılmaktadır HOS insan, 143b ve Saos-2 osteosarkoma hücre hattı.
LacZ ifade kez kararlı garantilidir, bu tekniğin mekanistik doku kolonizasyonu 13 gibi metastatik lezyonlar 15 eradikasyonu hedefleyen yeni tedavilerin geliştirilmesi ve test sürecini araştırmak için örneğin gen-manipüle tümör hücreleri ile çalışmalarda uygulanabilir , 16. Ayrıca, metastatik lezyonların erken tanısında kullanılan PET, (mikro) BT ve MRG gibi güncel radyolojik görüntüleme teknikleri, iyileştirilmesi için bir kriter olarak hizmet verebilir. Farklı izleyiciler ile yeni PET çalışmasında (yayımlanmamış) biz in vivo tespit akciğer açıklanan protokol ile sonradan ex vivo metastazları doğrulanmadı. Yeni bir küçük hayvan mikro-BT ile devam eden bir çalışmada (SkyScan) biz bugüne kadar ab vardırle 0,5 mm ve ex vivo aşağı 0,3 mm bir boyuta in vivo akciğer metastazları aşağı algılamak için, ama biz 0.1 mm çözünürlükte hedefliyoruz. İlginçtir, bu biz in-situ perfüzyon ve X-Gal boyama kombine yöntemi ile mikrometastaz makro-ayırt etmek ayarladığınız boyut sınırıdır. Bu da yine bu kolay ve maliyet-etkili bir tekniğin duyarlılık ve kullanışlılığı altını çiziyor.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar akciğer perfüzyon tekniği onun tavsiye için Dr Lubor Borsig (Fizyoloji Enstitüsü, Zürih Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Kanton Zürih Krebsliga, Walter L. ve Johanna Kurt Vakfı, Zürih, Lydia Hochstrasser Vakfı, Zürih, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı, SNF, İsviçre, Schweizerischer Verein Balgrist ve Üniversitesi bağışları ile desteklenmiştir Zürih.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
Nuclear-Fast Red – Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 |
Table 1. Reagents and Equipment.