이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.
utero의 electroporation에 (IUE) 배아 신경계 1-5의 여러 영역의 발달을 연구하는 강력한 기술이되고있다. 이 도구는 널리 세포 증식, 분화, 특히 개발하는 대뇌 피질의 연결 6-8에서는 마이 그 레이션의 규정을 연구하는 데 사용되었습니다 데이트를합니다. 다음은 세부의 프로토콜을 utero에서 대뇌 피질과 해마를 electroporate이 접근법은 두 대뇌 지역 dendrites 및 쪽이을 공부하는 데 사용될 수있는 증거를 제공합니다.
차 문화의 뉴런의 시각화 및 조작은 dendrite, 척추 및 시냅스 개발에 참여 과정의 더 나은 이해에 기여했습니다. 그러나 체외에서 성장 뉴런은 정상 개발하는 동안 dendrite 및 / 또는 척추 형성과 유지 보수에 영향을 미칠 수있는 모든 생리적 단서에 노출되지 않습니다. dendrite와 척추 구조의 지식 <e야생 형 또는 돌연변이 생쥐에서 생체내의 M>은 잠돌군 Zz-콕스 방법 9를 사용 관찰에서 주로 온다. 그러나 잠돌군 Zz의 염색법은 예측할로 간주됩니다. 실제로 신경 세포와 섬유 책자의 그룹이 인접한 부분 염색법을 찾아볼 수없는 반면 특정 영역은 종종 완전히 스테인드 등장으로 무작위로 분류됩니다. 최근 연구 형광 구조의 IUE은 돌연변이 / 야생 형 생쥐 10-11 (그림 1A)에 dendrites, 쪽이뿐만 아니라 시냅스를 공부하는 매력적인 대안 방법을 대표하는 것으로 나타났습니다. 또한 마우스 knockouts의 세대에 비해, IUE는 특정 시간 창 동안 세포의 특정 인구에서 기능 연구의 이득과 손실을 수행하는 빠른 방법을 나타냅니다. 또한, IUE이 성공적으로 RNAi는 유전자 또는 shRNA 12 표현 이상의 시간적 제어를 수정하기 위해 접근 inducible 유전자 발현이나 inducible 함께 사용되었습니다. IUE 이러한 장점 때문에 opene했습니다D 새로운 치수뿐만 아니라 특정 대뇌 구조 (그림 1B)에서뿐만 아니라 발전의 특정 시점 (그림 1C)에 dendrites와 쪽이의 유전자 발현 / 억제의 효과를 공부할 수 있도록.
마지막으로, IUE은 dendrite, 척추 및 / 또는 시냅스 개발에 관련된 유전자 사이의 기능적 상호 작용을 식별할 수있는 유용한 도구를 제공합니다. 사실, 이러한 바이러스 같은 다른 유전자 전달 방법과는 달리, 그것은 세포의 동일한 인구에서 여러 RNAi 또는 transgenes을 결합하는 간단합니다.
요약에서는 IUE 이미 뇌 기능과 질병의 기본 분자 메커니즘의 특성화에 기여했으며 그것도 dendrites와 쪽이의 연구에 도움이되어야 강력한 방법입니다.
IUE가 우주에서뿐만 아니라 시간뿐만 아니라 유전자 발현을 조작하기위한 강력한 도구입니다. 우리는이 기술은 대뇌 피질과 생쥐의 해마에서 dendrites 및 쪽이을 시각화하고 유전자 조작하는 데 사용할 수있는 것을 여기에 표시됩니다. 이전에 인용된 장점 외에, 그것은 IUE이 방법을 잠돌군 Zz와는 달리, immunohistochemistry이나 표현형 electroporated 세포에 대한 예를 들어 허용 원위치 하이브리드화에서 조합하여 사용할 수 있습니다 협조할 것입니다. 이 절차는 상대적 invasiveness에도 불구하고 분명 뇌의 기형을 유발하지 않는다는 언급하는 것도 중요합니다. 또한, 세포 수준에서 IUE는 electroporated 뉴런 13 electrophysiological 속성을 수정하지 않습니다. 우리의 시위가 dendrite와 척추 morphologies의 시각화에 초점을 맞춘 반면, E14.5에서 대뇌 피질이나 hippocampal 뉴런의 IUE은 또 축삭 형성과지도와 같은 다른 발달 이벤트를 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 추가할에서ition, 프로토콜의 같은 종류의 서로 다른 인구를 대상으로 배아 발달의 다른 단계에서 구현할 수 있습니다. 예를 들어, E18.5의 발달 늦게 피질 electroporation 패러다임은 astrocytic progenitors 1 식을 운전을 수행할 수 있습니다. E14.5에서 해마의 electroporation도 같은 시간에 CA1-CA3 피라미드 신경 세포의 progenitors과 이가있는 과립 세포 시조를 타겟팅할 수있는 동안 마찬가지로, 늦은 hippocampal electroporation은 (E18.5 또는 초기 출생 후의) 다른 이가있는 과립에 게재되는 것을 허용 것이다 progenitors 14. 이 경우, DNA의 주입 부피는 전류의 강도뿐만 아니라 증가 수 있습니다.
IUE에 의해 도입된 Transgenes는 episomal 유지 것으로 보인다 따라서 연속적으로 세포 분열에 따라 세포에서 손실됩니다. 이러한 뉴런과 같은 postmitotic 세포 그러나 episomal transgenes는 장기적인 연구를 할 수 있도록 13 electroporation 후 몇 달 동안 활성 상태로 유지15. 우리의 연구에서 우리는 초기 개발 시간 지점에서 transgene의 영구 식에 IUE 결과를 이용하여 대뇌 피질이나 hippocampal의 연결을 엽 성의 전구 물질을 목표로 그 배아를 나타내는 출산 후 칠주 (우리가 분석한 최신 시점)에 밝은 GFP + 세포를 관찰했습니다 성인 있습니다.
기술의 현재의 한계는 그것이 electroporated 세포의 총수 이상의 미세 제어를 발휘하기 어렵다는 점이다. 그러나 DNA 솔루션의 주입 부피를 줄임으로써, 우리는 몇 세포 레이블을 지정하고 고립된 GFP + 세포뿐만 아니라 쪽이의 돌기 arborization을 시각화하는 것이 가능하는 것으로 나타났습니다. transfected 영역의 차원은 또 현재와 펄스의 숫자 또는 electroporation의 심폐의 직경의 강도 등 electroporation의 매개 변수를 수정하여 조정할 수있다.
개의 IUE는 구현하기가 쉽고 빠른있는 방법이며,생체내의 dendrites 및 쪽이을 공부하는 효율.
The authors have nothing to disclose.
저자는 무균 절차 아래 utero의 electroporation으로 수행하기 위해 그들의 도움 박사 캐슬린 매더스는 박사 장 – 필립 Mocho 박사 욜란다 사베드라 토레스 감사드립니다, 그리고 그녀의 도움 헤일리 우드 그림을 준비합니다.
EP는 엘리자베스 피셔와 빅터 Tybulewicz에 Wellcome 신탁 기금에 의해 유럽 생물 학회의 장기 연맹 (FEBS) 친교 및 의학 연구위원회 (MRC) 경력 개발 화목, MAH (080174/B/06/Z)에 의해 지원되었다 , HW MRC의 학생이기 의한 EMBO 장기적인 교제와 RA에 의한. 이 작품은 Wellcome 트러스트 (086947/Z/08/Z)에서 프로젝트 교부금에 의해 및 권한 부여-원조 의학 연구 협의회 (U117570528)부터 FG에 의해 지원되었다
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | |||
Preparation of needles and DNA solution for injection | ||||||
Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | ||||
Fast Green | Sigma | F-7258 | ||||
Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | ||||
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl | |||
Material for surgery | ||||||
Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | ||||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | ||||
Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | ||||
Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | ||||
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | ||||
Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson & Johnson) | W9074 | ||||
Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | ||||
Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | ||||
Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | ||||
Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | |||||
Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | ||||
Eye gel Viscotears | Novartis | |||||
Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | ||||
Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | |||||
Electroporation | ||||||
Electroporator | BTX | ECM830 | ||||
Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | ||||
Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | ||||
Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | ||||
Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | ||||
Tissue processing | ||||||
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||||
Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | ||||
Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | ||||
Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | ||||
Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 |