この資料では詳細に子宮内で大脳皮質およびマウスのE14.5における海馬をエレクトロポためのプロトコルについて説明します。また、このこれらの2つの脳領域で樹状突起と棘を研究する貴重な方法であることを示している。
子宮内エレクトロポレーション(IUE)胚の神経系1-5の異なった地域の発展を研究するための強力な手法となっています。このツールは広く細胞増殖、分化、特に大脳皮質6-8の神経細胞移動の調節を研究するために使用された日付ます。ここでは詳細私たちのプロトコルを子宮内で大脳皮質および海馬をエレクトロポ、このアプローチは、これら二つの脳領域における樹状突起と棘を研究するために使用することができる証拠を提供する。
初代培養の神経細胞の可視化と操作は、樹状突起、スパインとシナプスの開発に関与するプロセスの理解に貢献しています。しかし、in vitroで成長してニューロンが正常な発達中の樹状突起および/または脊椎の形成と維持に影響を与える可能性がすべての生理的な手がかりには公開されません。樹状突起と脊椎の構造の知識<e野生型または変異マウスにおけるin vivoでm>は、ゴルジ-コックス法9を使用しての観測から来ている。しかし、ゴルジ染色は予測できないと見なされます。確かに、神経細胞と繊維管のグループは、隣接する領域は染色を欠いている間の特定の領域は、しばしば完全に染色された表示されると、ランダムにラベルが付けられています。最近の研究では、蛍光灯の構造のIUE変異体/野生型マウス10-11( 図1A)に樹状突起、棘などのシナプスを研究するための魅力的な代替方法を表していることが示されている。また、マウスのノックアウトの世代と比較して、IUEは、特定の時間帯に細胞の特定の集団における機能の研究の利得と損失を実行するための迅速なアプローチを表しています。さらに、IUEは、正常遺伝子またはshRNA 12の過剰発現時間制御を改良する誘導性遺伝子の発現または誘導性RNAiアプローチで使用されています。 IUEのこれらの利点は、このようにopene持っているD新しい寸法だけではなく、特定の脳構造( 図1B)でなく、開発の特定の時点( 図1C)における樹状突起と棘上の遺伝子の発現/抑制の効果を検討します。
最後に、IUEは、樹状突起、背骨、そして/または、シナプスの開発に関与する遺伝子間の機能的相互作用を識別するための便利なツールを提供しています。確かに、ウイルスなど他の遺伝子導入法とは対照的に、それが細胞の同じ集団内で複数のRNAiまたは導入遺伝子を組み合わせることは簡単です。
要約すると、IUEは、すでに脳機能や病気の根底にある分子機構の特性に貢献してきました、それはまた、樹状突起と棘の研究に有用なはずである強力な方法です。
IUEは、スペースでなく、時間だけでなく、遺伝子発現を操作するための強力なツールです。我々は、この技術は、マウスの大脳皮質と海馬の樹状突起と棘を視覚化し、遺伝的に操作するために使用することができますここで表示されます。以前に引用した利点に加え、それはIUEは、メソッドがゴルジ体へとは対照的に、免疫組織化学、あるいは表現型エレクトロポレーションした細胞を例にすることができsituハイブリダイゼーションにおいて結合することができますことは注目に値する。このプロシージャは、その相対的侵襲性にもかかわらず、明らかな脳の奇形を誘発しないことについて言及することも重要です。さらに、細胞レベルでは、IUEは、エレクトロポレーションのニューロン13の電気生理学的特性を変更しません。私たちのデモでは、樹状突起とスパイン形態の可視化に焦点を当てているが、E14.5における皮質または海馬ニューロンのIUEはまた、軸索形成およびガイダンスのような他の発達イベントを研究するために使用される可能性があります。追加でition、プロトコルの同じ種類の異なる集団を対象とする胚発生の他の段階で実装することができます。たとえば、E18.5で発達が非常に遅く皮質のエレクトロポレーションのパラダイムは、アストロサイト前駆細胞が1で発現を駆動するために実行することができます。同様に、E14.5における海馬のエレクトロポレーションが同時にCA1-CA3錐体細胞の前駆細胞および歯状回顆粒細胞の前駆細胞を標的とすることができますが、後半に海馬のエレクトロポレーション(E18.5または出生後早期)が別の歯状回顆粒をターゲットにできるようになる前駆細胞14。このケースでは、DNAの注入量は、電流の強さと同様に増加することができます。
IUEによって導入された導入遺伝子はエピソームのままのように見えるため、連続する細胞分裂後の細胞から失われています。このようなニューロンとして分裂細胞では、しかし、エピソームの導入遺伝子は、エレクトロポレーションは、長期試験13を許した後、月間アクティブのまま、15。私たちの研究では、胚の初期の発達時点アップから導入遺伝子の持続的な式でIUE結果を用いて皮質または海馬の神経前駆細胞を標的とすることを示す(ここでは分析した最新の時点)、出生後7週間に明るいGFP +細胞を観察した成人期へ。
技術の電流制限は、エレクトロポレーションした細胞の総数を細かく制御を行使することは困難であるということです。しかし、DNA溶液の注入量を減少させることによって、我々は、少数の細胞を標識するために、孤立したGFP +細胞だけでなく、その棘の樹状突起分枝を可視化することが可能であることが示されている。トランスフェクトされた領域の寸法は、また、電流とパルス数またはエレクトロポレーションパドル径の強度としてエレクトロポレーションのパラメータを変更して調整することができます。
完全にIUEは、迅速、簡単に実装できる方式であるとin vivoでの樹状突起と棘を学ぶことが効率的です。
The authors have nothing to disclose.
著者は彼らの助け無菌手続きの下で子宮内エレクトロポレーションで実行するために、図面を準備する彼女の助けのためにヘイリー·ウッド博士のキャスリーン·マザーズ博士ジャン·フィリップ·Mocho博士ヨランダサアベドラ·トーレスに感謝します。
EPは、エリザベス·フィッシャーとビクターTybulewiczにウェルカムトラスト助成により、欧州の生化学的社会の長期的な連合(FEBS)の交わりと医学研究評議会(MRC)キャリア開発のフェローシップ、MAH(080174/B/06/Z)によってサポートされていました、HW EMBO長期的な親睦とRAによるMRCの学生の身分で。この作品は、ウェルカム·トラスト(086947/Z/08/Z)からプロジェクトの助成金によってとFGの医学研究評議会(U117570528)からの補助金によってサポートされていました
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | |||
Preparation of needles and DNA solution for injection | ||||||
Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | ||||
Fast Green | Sigma | F-7258 | ||||
Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | ||||
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl | |||
Material for surgery | ||||||
Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | ||||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | ||||
Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | ||||
Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | ||||
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | ||||
Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson & Johnson) | W9074 | ||||
Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | ||||
Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | ||||
Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | ||||
Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | |||||
Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | ||||
Eye gel Viscotears | Novartis | |||||
Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | ||||
Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | |||||
Electroporation | ||||||
Electroporator | BTX | ECM830 | ||||
Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | ||||
Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | ||||
Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | ||||
Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | ||||
Tissue processing | ||||||
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||||
Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | ||||
Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | ||||
Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | ||||
Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 |