Denne artikkelen beskriver i detalj en protokoll til electroporate i utero hjernebarken og hippocampus hos E14.5 i mus. Vi viser også at dette er en verdifull metode for å studere dendritter og pigger i disse to cerebrale regioner.
I fosterlivet electroporation (IUE) har blitt en effektiv teknikk for å studere utviklingen av ulike regioner av embryonale nervesystemet 1-5. Hittil dette verktøyet har vært mye brukt til å studere reguleringen av cellulær proliferasjon, differensiering og neuronal migrasjon spesielt i utviklingsland hjernebarken 6-8. Her har vi detalj vår protokoll til electroporate i utero hjernebarken og hippocampus og gi bevis for at denne tilnærmingen kan brukes til å studere dendritter og pigger i disse to cerebrale regioner.
Visualisering og manipulering av nerveceller i primære kulturer har bidratt til en bedre forståelse av prosessene som er involvert i dendrite, ryggraden og synapse utvikling. Men nevroner voksende in vitro ikke utsettes for alle de fysiologiske signaler som kan påvirke dendrite og / eller ryggrad dannelse og vedlikehold under normal utvikling. Vår kunnskap om dendrite og ryggrad strukturer <em> in vivo i villtype eller mutant mus kommer hovedsakelig fra observasjoner ved hjelp av Golgi-Cox metode 9. Men Golgi flekker anses å være uforutsigbar. Faktisk er grupper av nerveceller og fiber traktater merket tilfeldig, med spesielle områder ofte vises helt beiset mens tilstøtende områder er blottet for farging. Nyere studier har vist at IUE av fluorescerende konstruksjoner representerer et attraktivt alternativ metode for å studere dendritter og pigger samt synapser i mutant / villtype mus 10-11 (figur 1A). Videre i forhold til produksjon av mus knockouts, representerer IUE en rask tilnærming til å utføre gevinst og tap av funksjon studier i spesifikke populasjon av celler i løpet av en bestemt tid vindu. I tillegg har IUE blitt brukt med induserbar genekspresjon eller induserbar RNAi tilnærmingsmåter for å avgrense tidsmessige kontroll over uttrykket av et gen eller shRNA 12. Disse fordeler IUE har dermed opened nye dimensjoner for å studere effekten av genuttrykk / undertrykking på dendritter og ryggrader ikke bare i spesifikke cerebrale strukturer (Figur 1B), men også på et bestemt tidspunkt i utviklingen (figur 1C).
Til slutt gir IUE et nyttig verktøy for å identifisere funksjonelle samspillet mellom gener involvert i dendrite, ryggrad og / eller synapse utvikling. Faktisk, i motsetning til andre genoverføring metoder som virus, er det enkelt å kombinere flere RNAi eller transgener i samme populasjon av celler.
Oppsummert er IUE en kraftig metode som allerede har bidratt til karakterisering av molekylære mekanismene bak hjernens funksjon og sykdom, og det bør også være nyttig i studiet av dendritter og pigger.
IUE er et kraftig verktøy for å manipulere genuttrykket ikke bare i verdensrommet, men også i tid. Vi viser her at denne teknikken kan brukes til å visualisere og genetisk manipulere dendritter og pigger i hjernebarken og hippocampus hos mus. Foruten de fordelene som tidligere sitert, er det verdt å merke seg at IUE, i motsetning til Golgi-metoden, kan kombineres med immunhistokjemi eller in situ hybridisering, som tillater for eksempel å fenotype de electroporated cellene. Det er også viktig å nevne at denne fremgangsmåten ikke induserer åpenbare hjernen misdannelser tross for sin relative invasivitet. I tillegg, på cellenivå, ikke IUE ikke endre elektrofysiologiske egenskaper electroporated nevroner 13. Mens vår demonstrasjon fokuserer på visualisering av dendrite og ryggrad morfologi, kunne IUE av kortikale eller hippocampus nevroner ved E14.5 også brukes til å studere andre utviklingsforstyrrelser hendelser som axon formasjon og veiledning. I leggeition, samme type protokoll kan gjennomføres ved andre stadier av embryoutvikling å målrette ulike populasjoner. For eksempel kan en utviklingshemmede veldig sent kortikal electroporation paradigmet på E18.5 utføres for å kjøre uttrykk i astrocytic stamfedre 1. Tilsvarende mens en electroporation av hippocampus ved E14.5 gjør det mulig å målrette CA1-CA3 pyramidale nevroner stamfedre og dentate granule celle progenitor samtidig, ville en sen hippocampus electroporation (E18.5 eller tidlig postnatal) tillate å målrette ulike dentate granule stamfedre 14. I dette tilfellet kan det injiserte volumet av DNA økes, samt intensiteten i strømmen.
Transgener introdusert av IUE synes å forbli episomal og er derfor tapt fra celler etter rad celledelinger. I postmitotic celler som nerveceller, men de episomal transgener forblir aktive i flere måneder etter electroporation slik langtidsstudier 13, 15. I vår studie har vi sett lyse GFP + celler opp til 7 uker etter fødselen (den nyeste tidspunktet vi analyserte) indikerer at embryonale målretting av kortikale eller hippocampus nevrale forløpere bruker IUE resultater i vedvarende uttrykk for transgene fra tidlige utviklingsforstyrrelser tidspunkter opp til voksenlivet.
En gjeldende begrensning av teknikken er at det er vanskelig å utøve en god kontroll over det totale antall electroporated celler. Men ved å redusere det injiserte volumet av DNA-løsning, har vi vist at det er mulig å merke noen få celler og til å visualisere dendrittiske arborization av isolerte GFP + celler samt deres pigger. Dimensjonen på transfekterte området kan også bli justert ved å endre parametrene av electroporation som intensitet av nåværende og antall pulser eller diameteren på electroporation padleårer.
Tilsammen IUE er en metode som er enkel å implementere, rask ogeffektivt å studere dendritter og ryggrader in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Dr. Kathleen Mathers, Dr. Jean-Philippe Mocho og Dr. Yolanda Saavedra Torres for deres hjelp til å utføre i utero electroporation under aseptiske prosedyrer, og Hayley Wood for hennes hjelp til å forberede tegningene.
EP ble støttet av en langsiktig Federation of European Biokjemiske Societies (FEBS) fellesskap og en Medical Research Council (MRC) karriereutvikling fellesskap, Mah ved en Wellcome Trust stipend til Elizabeth Fisher og Victor Tybulewicz (080174/B/06/Z) , HW av en embo langsiktig fellesskap og RA ved en MRC studentship. Dette arbeidet ble støttet av et prosjekt stipend fra Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) og av en Grant-i-Aid fra Medical Research Council (U117570528) til FG
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | |||
Preparation of needles and DNA solution for injection | ||||||
Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | ||||
Fast Green | Sigma | F-7258 | ||||
Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | ||||
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl | |||
Material for surgery | ||||||
Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | ||||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | ||||
Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | ||||
Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | ||||
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | ||||
Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson & Johnson) | W9074 | ||||
Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | ||||
Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | ||||
Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | ||||
Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | |||||
Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | ||||
Eye gel Viscotears | Novartis | |||||
Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | ||||
Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | |||||
Electroporation | ||||||
Electroporator | BTX | ECM830 | ||||
Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | ||||
Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | ||||
Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | ||||
Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | ||||
Tissue processing | ||||||
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||||
Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | ||||
Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | ||||
Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | ||||
Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 |