Denna artikel beskriver i detalj ett protokoll till elektroporera i livmodern hjärnbarken och hippocampus vid E14.5 hos möss. Vi visar också att detta är en värdefull metod för att studera dendriter och ryggar i dessa två cerebrala regioner.
In utero elektroporering (IUE) har blivit en kraftfull teknik för att studera utvecklingen av olika regioner av den embryonala nervsystemet 1-5. Hittills detta verktyg allmänt har använts för att studera regleringen av cellulär proliferation, differentiering och neuronal migrering speciellt i utvecklingen av cerebral cortex 6-8. Här har vi närmare vårt protokoll för att elektroporera i livmodern hjärnbarken och hippocampus och ge bevis för att detta tillvägagångssätt kan användas för att studera dendriter och ryggar i dessa två cerebrala regioner.
Visualisering och manipulering av neuroner i primära kulturer har bidragit till en bättre förståelse av de processer som är involverade i dendrit, ryggen och synaps utveckling. Men nervceller växer in vitro inte utsätts för alla de fysiologiska signaler som kan påverka Dendrite och / eller ryggrad bildning och underhåll under normal utveckling. Vår kunskap om dendritiska och ryggrad strukturer <em> in vivo i vildtyp eller mutant möss kommer främst från observationer med hjälp av Golgi-Cox-metoden 9. Dock Golgi färgning vara oförutsägbar. I själva verket grupper av nervceller och skrifter fiber märkt slumpmässigt, med specifika områden ofta visas helt färgade medan intilliggande områden saknar färgning. Nyligen genomförda studier har visat att IUE av fluorescerande konstruktioner representerar en attraktiv alternativ metod för att studera dendriter, ryggar samt synapser i mutanta / vildtyp möss 10-11 (Figur 1A). Dessutom i jämförelse med generering av mus knockouts representerar IUE en snabb metod för att utföra vinst och förlust av funktion studier i specifik population av celler under en viss tid. Dessutom har IUE framgångsrikt använts med inducerbar genexpression eller inducerbar RNAi närmar att förfina temporal kontroll över uttrycket av en gen eller shRNA 12. Dessa fördelar har IUE opene sålundad nya dimensioner för att studera effekten av genuttryck / dämpning på dendriter och ryggar inte bara i vissa cerebrala strukturer (Figur 1B), men också vid en viss tidpunkt i utvecklingen (figur 1C).
Slutligen ger IUE ett användbart verktyg för att identifiera funktionella interaktioner mellan gener involverade i dendrit, ryggen och / eller synaps utveckling. I själva verket, till skillnad från andra genöverföringsmetoder såsom virus, är det enkelt att kombinera multipla RNAi eller transgener i samma cellpopulation.
Sammanfattningsvis är IUE en kraftfull metod som redan har bidragit till karakterisering av molekylära mekanismer som ligger bakom hjärnfunktion och sjukdom och den bör också vara användbara vid studium av dendriter och ryggar.
IUE är ett kraftfullt verktyg för att manipulera genexpression inte bara i rummet utan även med tiden. Vi visar här att denna teknik kan användas för att visualisera och genetiskt manipulera dendriter och ryggar i hjärnbarken och hippocampus hos möss. Förutom de fördelar som tidigare nämnda, är det värt att notera att IUE, i motsats till Golgi-metoden, kan kombineras med immunohistokemi eller hybridisering in situ, vilket tillåter exempelvis att fenotyp de elektroporerade cellerna. Det är också viktigt att nämna att detta förfarande inte inducerar tydliga hjärnan missbildningar trots sin relativa invasivitet. Dessutom, på cellnivå, ändrar IUE inte de elektrofysiologiska egenskaperna hos de elektroporerade neuroner 13. Även om vår demonstration fokuserar på visualisering av dendritiska och ryggrad morfologier kunde IUE av kortikala eller hippocampus neuroner vid E14.5 också användas för att studera andra utvecklingsstörningar händelser såsom axon formation och vägledning. I Lägg tillition, samma typ av protokoll kan genomföras på andra stadier av embryonal utveckling för att rikta olika populationer. Till exempel kan en utvecklingsmässigt mycket sent kortikala elektroporering paradigmen vid E18.5 utföras för att driva expression i astrocytiska progenitorer 1. Liknande sätt, medan en elektroporation av hippocampus vid E14.5 tillåter att rikta CA1-CA3 pyramidala neuroner progenitorer och gyrus granul-cell ursprungsceller samtidigt, skulle en sen hippocampus elektroporering (E18.5 eller tidiga postnatala) tillåter att rikta olika gyrus granul stamfäder 14. I detta fall kan den injicerade volymen av DNA ökas såväl som intensiteten hos strömmen.
Transgener införs genom IUE verkar vara episomala och därför förlorade från celler på varandra följande celldelningar. I postmitotiska celler såsom neuron dock de episomala transgenerna förblir aktiva under flera månader efter elektroporering möjliggör långtidsstudier 13, 15. I vår studie har vi observerat ljusa GFP + celler upp till 7 veckor efter födseln (den senaste tidpunkt vi analyserat) pekar på att embryonal inriktning på kortikala och hippocampus neuronala prekursorer med IUE orsakar bestående uttryck av transgenen från tidiga utvecklingsstadier tidpunkter upp till vuxen ålder.
En ström begränsning av denna teknik är att det är svårt att utöva en exakt kontroll över det totala antalet elektroporerade celler. Emellertid, genom att minska den injicerade volymen av DNA-lösning, har vi visat att det är möjligt att märka ett fåtal celler och att visualisera den dendritiska förgrening av isolerade GFP + celler, såväl som deras ryggar. Dimensionen för den transfekterade området skulle också kunna justeras genom att modifiera parametrarna i elektroporering såsom intensiteten hos strömmen och antalet pulser eller diametern hos de elektroporation paddlar.
Sammantaget IUE är en metod som är enkel att implementera, snabb ocheffektiv för att studera dendriter och ryggar in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Kathleen Mathers, Dr Jean-Philippe Mocho och Dr Yolanda Saavedra Torres för deras hjälp att utföra i livmodern elektroporation under aseptiska rutiner och Hayley Wood för hennes hjälp för att förbereda ritningar.
EP fick stöd av en långsiktig Federation of European Biochemical Societies (FEBS) gemenskap och en Medical Research Council (MRC) karriärutveckling gemenskap, MAH av Wellcome Trust bidrag till Elizabeth Fisher och Victor Tybulewicz (080174/B/06/Z) , HW med ett EMBO långsiktig gemenskap och RA av en MRC forskarnivå. Detta arbete stöds av ett projektbidrag från Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) och av en Grant-i-Stöd från Medical Research Council (U117570528) till FG
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | |||
Preparation of needles and DNA solution for injection | ||||||
Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | ||||
Fast Green | Sigma | F-7258 | ||||
Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | ||||
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl | |||
Material for surgery | ||||||
Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | ||||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | ||||
Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | ||||
Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | ||||
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | ||||
Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson & Johnson) | W9074 | ||||
Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | ||||
Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | ||||
Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | ||||
Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | |||||
Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | ||||
Eye gel Viscotears | Novartis | |||||
Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | ||||
Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | |||||
Electroporation | ||||||
Electroporator | BTX | ECM830 | ||||
Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | ||||
Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | ||||
Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | ||||
Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | ||||
Tissue processing | ||||||
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||||
Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | ||||
Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | ||||
Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | ||||
Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 |