Оптимизирована процедура для флуоресцентной активированного сортировки клеток (FACS) Выделение вегетативной нервной прародителей из висцеральных органов плода мышей

Summary

Оптимизированные процедуры для очищения нервного гребня, полученные от предшественников нейронов фетальных тканей мыши описано. Этот метод использует выражение из флуоресцентного аллелей репортер, чтобы изолировать отдельные группы по флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS). Этот метод может применяться для изоляции нейронов субпопуляции на протяжении всего развития или из взрослых тканей.

Protocol

1. Подготовка Media (все шаги сделал в ткани капот культуры)

1. Смешайте следующие: 44 мл L-15 средняя, ​​0,5 мл 100X пенициллина / стрептомицина (P / S), 0,5 мл 100 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 0,5 мл 1М HEPES, 5 мл культуры ткани класса воде. Будьте уверены, чтобы смешивать BSA и P / S тщательно, прежде чем добавлять. Эта книга должна быть достаточной для диссоциации до пяти различных типов тканей. Этот носитель будет использоваться в шаге от 3,4 до подготовки тушения решения для использования после ферментативного распада тканей.
2. Фильтрующий материал, хотя 0,22 мкм Полиэфирсульфон (PES) фильтр.
3. Подготовить сбалансированный солевой 1X Хэнка Решение (HBSS) и 1X фосфатного буфера (PBS) с 10х Акции использованием культуры тканей класса водой. Фильтр по 0,22 мкм PES фильтр. Большие объемы этих реагентов можно приготовить заранее и хранить при температуре 4 ° C, аликвоты меньших объемах в капюшоне культуры ткани по мере необходимости.
4. Заполнить несколько 15 мл конические пробирки с 1X HBSS (количество трубок равного количества тканей вы планируете к югу от вскрытия) хранение труб на льду.

2. Рассечение

1. Эвтаназии приурочен беременных мышей в соответствии с институциональными ухода за животными и использованию комитет утвердил протоколы и передачи матки в 60 или 100 мм чашки Петри содержащих ледяной 1X PBS.
2. Удалить эмбрионов из матки и эвтаназии путем обезглавливания в ледяной 1X PBS. Экран индивидуально под флуоресценции освещение, деление на положительных и трансгенных дикого типа (WT) нетрансгенные бассейнов. Держите эмбрионов в ледяной 1X PBS всей рассечение.
3. При вскрытии микроскоп, к югу от рассекать урогенитального тракта. Держите эмбриона в месте в лапы уровня с прекрасным щипцами. Удалите внутренности из печени вплоть до половой бугорок, вставив щипцы на уровне диафрагмы, то бодро тянет внутренних органов вниз и далеко от дорсальной стенки тела.
4. Далее к югу от рассекать тканипроценты от окружающих тканей (рис. 1). Поместите каждое в отдельности, к югу от расчлененного типа ткани в 15 мл коническую трубку с ледяной 1X HBSS. Бассейн каждого типа ткани вместе в соответствии с эмбрионом фенотип (то есть все GFP + образцы эмбрионального кишечника объединяются в одну 15 мл коническую трубку).
5. Параллельно с этим, анализировать сопоставимые ткани дикого типа эмбрионов использовать для компенсации контроля в проточной цитометрии.

3. Диссоциация Subdissected тканей

1. Гранул суб-расчлененный тканей путем центрифугирования при 210 Относительная центробежная сила (RCF), 4 ° C в течение 5 мин. После центрифугирования, аспирации от такого большого HBSS насколько это возможно.
2. Ресуспендируют ткани гранул в Accumax (Инновационные технологии Cell, Inc), будучи уверенным, что менять наконечники от каждого образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения тканей. Количество Accumax добавленную могут быть расширены для большего или меньшего количества ткани. Обычно в течение 1-5 Плода образцы кишечника, 1 мл Accumax будет использоваться, но больше бассейнов ткани потребуется больший объем для достижения диссоциации.
3. Место трубы на 37 ° С на водяной бане 20-45 мин в зависимости от стадии ткани оказаться в изоляции (например, 13,5 DPC кишечника 20 мин, 15,5 DPC кишечника 35 мин). На полпути, хотя время диссоциации, вручную разбить ткани, нокаутировав трубку к стенке водяной бане (или любую твердую поверхность) и "щелкать" трубки (как можно было бы тряхнуть старомодный ртутный термометр). В конце времени диссоциации повторить утрясать процедуру несколько раз, чтобы дальше отмежеваться образца. Для более хрупкие образцы, уменьшить энергичность от дрожания вниз и вместо этого использовать пипетки растирания в шаге от 3,5 до достижения соответствующего уровня диссоциации. Типичное время диссоциации 14,5 и 15,5 DPC DPC LUT на 35 и 45 минут соответственно.
4. В то время как ткани инкубации в Accumax, составляют так тушенияРезолюции, называется угашайте и утолить 1:5. Quench производится путем добавления 45 мкл 5 мг / мл ДНКазы I до 6 мл L-15 СМИ. Угашайте 1:05 производится путем добавления 45 мкл 5 мг / мл ДНКазы I до 30 мл L-15 СМИ.
5. В конце диссоциации, двигаться 15 мл труб на лед и сразу же добавляют 1 мл Quench в каждую пробирку. Измельченного в порошок каждого образца вверх и вниз, пока ткань почти полностью диссоциированных (рис. 2). Там еще будут небольшие куски ткани, присутствующих в растворе. Достижение полностью однородный образец не является легко достижимым, ни желательным, как это может привести к снижению жизнеспособности клеток.
6. Храните образцы на льду как можно больше на оставшуюся часть протокола. Обязательно используйте свежий наконечник пипетки при пипетки до закалочной или угашайте 1:05, чтобы избежать перекрестного загрязнения образцов.

4. Фильтрация суспензии клеток

1. Используя щипцы, которые были пропитанной 70% этанолом, поместите 3 см, площадью 38 мкм мембраны нейлоновой сетке (SEFAR Америки) поустья новый 15 мл коническую трубку. Фильтры клеток через сетку с помощью пипетки в центре мембраны использованием малого диаметра советы. Если мембрана становится насыщенным при фильтрации, удалите его, высушить рот трубки с kimwipe, а также использовать новый кусок нейлоновой сеткой для фильтрации остальной части клеточной суспензии. Когда все клетки были отфильтрованы, используя 1 мл угашайте 1:5 до промыть трубы и фильтровать все оставшиеся клетки.
2. При фильтрации завершена, или при замене забитый мембраны, использование щипцов, чтобы свернуть стороны сетки и протрите через мембраны верхней части трубки для удаления висящих капель клеток.
3. Гранул суспензии клеток путем центрифугирования при 210rcf, 4 ° С в течение 5 мин. Аспирируйте от супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл Quench 1:5.
4. Фильтры суспензии клеток через нейлоновую сетку труб на 5 мл полистирола. Промыть 15 мл трубку с 1 мл угашайте 1:5 и фильтр для захвата оставшихся клеток.

5. Подготовка проб для FACS

При использовании той же ткани для сортировки и компенсации управления, передачи ^1/10 до ^1/20-го объема образца на новый 5 мл полистирола трубы использовать для компенсации управления. Разделите дикого типа образец ткани на две части. Одна часть будет незапятнанным дикого типа (WT только), а вторая половина будет иметь 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, люминесцентные интеркалятора исключены из живых клеток, используемых в качестве "жизнеспособность пятно") добавил к нему (7-AAD только ). Эти отдельные элементы управления необходимо, чтобы для компенсации любого спектрального перекрытия между излучением дискретных флуорофоров на поток сортировщика. Например, для одного репортера, как люминесцентные EGFP, необходимый контроль будет включать: EGFP только безупречной WT клеток, и трубы окрашивают с 7-AAD только (рис. 3).

Заполните все 5 мл пробирки, содержащие суспензии клеток с Quench 1:5 и центрифуги в 210rcf, 4 ° С в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант, в результате чего около 200 мкл жидкостив трубке.

Развести 7-AAD 1:1000 в Quench 1:5. Добавить 7-AAD окрашивания разбавления до 7-AAD только контроль компенсации и образцов для сортировки. Не добавляйте 7-AAD с EGFP или только WT только контроль компенсации. Объем 7-AAD быть добавлены будет варьироваться в зависимости от количества исходного материала и размера осадок клеток получены. После 7-AAD была добавлена ​​в каждую пробирку, пробы готовы для сортировки.

Ткань	Размер образца бассейн	Том 7-AAD которые будут добавлены к трубке *
15,5 DPC кишечника	1-5	200 мкл
15,5 DPC LUT	1-5	150 мкл

Таблица 1. Количество 7-AAD добавлены различные распадается ткань * Окончательная общая сумма в каждой трубке будет зависеть от суммы, начиная от 50-100 мкл, поскольку стремление СМИп приблизительно процесса и проводится, чтобы избежать гранул. Окончательные объемы не измеряются таким образом, чтобы свести к минимуму обработку клеток в растворе.

Подготовить набор труб для сбора клеток для выделения РНК путем добавления 0,75 мл TRIzol-LS в пробирки на 1,5 мл микроцентрифужных.

Если сбор клеток для культуры пробирке, а не РНК изоляции, вид клеток непосредственно в самообновлению СМИ в 6 пластин и культура ткани, покрытой фибронектином и наполнены средства массовой информации, как описано выше. ^2,6,7

6. Проточной цитометрии

1. В проточной цитометрии, оценить компенсации управления первого, будучи уверенным, что к спине промывать между каждого образца, чтобы избежать загрязнения. С помощью профилей компенсации образцы для установки напряжения / ворота для сортировки. Заметим, что если положительных клеток в ткани желаемого присутствуют в ограничении числа, различные ткани могут быть использованы для установления компенсации настройки до тех пор, как интенсивность флуоресценции и размера ячейкимежду образцами являются сопоставимыми.
2. Установите параметры компенсации и ворота, чтобы избежать мертвых клеток, которые занимают 7-AAD красителей и собирают клетки, обладающие высокой интенсивности флуоресценции GFP относительной к неокрашенные элементы управления (рис. 4).
3. Сортировка максимально 25000 клеток в каждом микроцентрифужных трубку. Сортировка должна быть выполнена по самым низким давлением с широким отверстием сопла и низкой скоростью потока (например, 17psi, 100 мкм, сопла, 3000 событий / сек), чтобы сохранить жизнеспособность нейронов предшественников. Для видов, чтобы изолировать EGFP + клеток мы выполняем наши изоляции на BD Biosciences FACSAriaII помощью 488nm 20mW лазер для возбуждения EGFP репортера.
4. Если образцы содержат высокие концентрации клетки, желательно, чтобы разбавить суспензию клеток дальнейшего использования 1:1000 7-AAD пятно для достижения более высокой эффективности захвата при сортировке.
5. Vortex каждую пробирку клеток, захваченных в TRIzol-LS сразу после сортировки.

7. Представитель Результаты

Ткани для производства диссоциации клеточные суспензии для потока сортировки тонкий баланс между адекватной ферментативного пищеварения и избегая чрезмерной пищеварения, что может привести к низкому viabilities клетки. Пример желаемого уровня ткани диссоциации показано на рисунке 2. В надлежащим переваривается ткани перед ручным части растирания к югу от расчлененного органов по-прежнему очевидны (рис. 2б, 2е). В тканях, которые ферментативно лечение слишком длительного периода времени или при слишком высокой концентрации фермента, полученной суспензии не хватает остаточного большие куски ткани (рис. 2-й, 2 часа).

Соответствующие диссоциации и ручной фильтрации производят рода профилей в проточной цитометрии, которые обычно демонстрируют более чем на 90% жизнеспособных клеток и показать высокий уровень экспрессии EGFP (рис. 4). Клеточные популяции, полученные этим методом иллюстрации хорошегожизнеспособность и могут быть записаны для последующей культуры и анализ экспрессии генов путем стробирования для захвата EGFP + нейронных предшественников.

Рисунок 1. Распределение TH-EGFP + предшественники нейронов плода LUT мыши. Всего монтажа урогенитального тракта в 15,5 ЦОД рассматривается вентрально при ярком освещении поля () по сравнению с распределением EGFP + клеток, помеченных TH-EGFP экспрессии трансгена, выявленные в рамках освещения флуоресценции (б). TH-EGFP выражение присутствует в надпочечниках (а) и медиально расположенных целиакией ганглиев (CG). Боковой (с) представление на 15,5 DPC TH-EGFP суб-расчлененный пузыря экспонатов флуоресценции от экспрессии трансгена в тазовых ганглиев (PG), стенки мочевого пузыря (бла) и мочеиспускательного канала (и). В вид сверху (г) EGFP + клеток видны в передней спинной уретры. Другие этикетки: почки (к), семенников (т), мочевого пузыря (бла) и половой бугорок (GT).

Рисунок 2. Светлое изображение 15 DPC плода LUT (а) и кишечника (д), соответственно, отображаемого на полпути через инкубационный период распада, в конце инкубационного диссоциации до разрушения (B, F), после ручной нарушения (с, г) и в образце, который был слишком диссоциированных (д, з).

Рисунок 3. Принципиальная схема иллюстрирует компенсации контролирует необходимые для установления строгого стробирования FACS параметров.

Рисунок 4. Представитель изображение профилей потоком вид на 14,5 ЦОД (а) и 15.5 DPC (б). Черное население состоит из одной клетки на основе прямого и бокового рассеяния, которые мертвы и помечены7-AAD флуоресценции. Серый население состоит из синглетного элементов на основе прямого и бокового рассеяния, которые исключены 7-AAD, и, таким образом, жизнеспособность. Зеленый закрытого населения указывает коробку "GFP +" области и состоит из одной клетки, которые исключены 7-AAD (жизнеспособных) и обладают EGFP флуоресценции.

Discussion

Мышь репортер линии, экспрессирующие флуоресцентные журналистам становятся доступными через многочисленные усилия в мышиной генетики сообщество ^1,8,9. В результате метод диссоциации показано здесь может широко применяться для изоляции дискретных нейронов подтипы на основе медиатора или модели экспрессии рецепторов либо плода или взрослых тканей. В то время как мы оптимизировали этот метод, основанный на выражение флуоресцентные репортер трансгенов, она также может быть применен к образцам выражения рецепторами клеточной поверхности, помеченных живой клетки иммунной маркировки методов ^3-5,10.

В наших руках, мы наблюдали несколько факторов, которые влияют на процент клеток, которые пережили процедуру диссоциации. Они включают время, прошедшее с начального рассечения тканей плода для изоляции клеток методом проточной цитометрии, бережное обращение с клеточной суспензии, как во время фильтрации и в течение сортировщик, а также фермента, используемого в dissociation. Выживание и кишечных и LUT предшественников выгоду от быстрого вскрытия / диссоциации и использование нежных условиях в течение сортировки клеток (17psi, 100 микрон сопла, 3000 событий / сек). Мы обнаружили, что до изоляции в течение сортировщик, от общей численности населения наблюдается материал по векселю (все события, включая мусор и мультиплетов), как правило выставлены около 80% выживания клетки распадается, полученной с эмбриональной кишки или LUT. Чтобы исключить мусор и скопления клеток, начальная ворота для прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) были наложены на общую численность населения. Тогда общая численность населения доработаны для «дочки» населения по напряжению импульса стробирования геометрии для ширины и высоты измерения ФСБ и КГБ, чтобы исключить дублетов. В этой изысканной "дочки" население нежизнеспособные клетки, 7-AAD + были исключены, так что единственным жизнеспособным клеток с флуоресцентными репортер EGFP были собраны. Мы обнаружили, что частота выживаемости нейроNAL предшественников в этом дочь населения был относительно низким, когда диссоциация была выполнена в смеси коллагеназы трипсин +, который обычно используется во многих случаях для этой цели (0,5% трипсина, Gibco, 10 мг / мл коллагеназы IV, Уортингтон) ^{2,5 - 7.} Чтобы получить более высокий процент выживания нейронов прародителей из LUT изолятов ткани, мы протестировали альтернативную фермент для лечения диссоциации тканей для получения суспензии клеток для потока сортировки (табл. 2). Нейронов предшественников выставлены улучшить жизнеспособность при диссоциации в dispase (5 мг / мл) щадящий метод диссоциации, которая часто используется для изоляции нейронных труб или других нейронных популяций предшественников ^11. Однако наибольший жизнеспособность наблюдается была получена с Accumax, запатентованную смесь протеазы, коллагенолитических деятельности и ДНКазы неизвестных пропорциях (табл. 2). Диссоциация в Accumax дали лучшее выживание и для кишечных нейронов предшественников нейронов и LUT пр.ogenitors с небольшими различиями в выживаемости между двумя источниками. Наши результаты показывают, что различные нейронные популяции могут отличаться по своей чувствительности к диссоциации условиях. Таким образом, исследователи пытаются изолировать нейронных предшественников или зрелые нейроны должны оценить диссоциации условий для выявления тех, которые производят наибольшее выживание клеток и выход для различных источников ткани. Метод описан служит отправной точкой для таких процедур в периферической нервной системе.

Ферментов в растворе диссоциация	% Выживаемости кишечной Н.П.	% Выживание LUT NP
Tryp + Collag	29,5 + / - 8,2%, п = 11	46,2 + / - 8,6%, п = 4
Dispase	35,1 + / - 9,8%, п = 10	46,3 + / - 6,6%, п = 9
Accumax	66,5 + / - 7,8%, п = 8	58,1 + / - 5,2%, п = 10

Таблица 2. Жизнеспособность нейронов предшественников (НП) в различных условиях диссоциации.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax	Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies)	A7089-100ML	Store frozen in 1 ml aliquots
DNase I	Sigma	D-4527	Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5)
10X PBS pH 7.4	Gibco	70011-044	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
10X HBSS w/o Ca or Mg	Gibco	14185-052	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	21083027
Penicillin /Streptomycin 100X	Gibco	15140-133	Store aliquoted at -20 °C
BSA	Sigma	A3912-100G	Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water
Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl	Lonza	17-737E
38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane	Sefar America	3-38/22	Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood.
7-AAD	Invitrogen	A1310	1 mg/ml
TRIzol LS	Invitrogen	10296-028
5 ml polystyrene tubes	Falcon	352058
15 ml conical tubes	Corning	430790
Fine Dissecting Forceps	Fine Science Instruments	11251-30	Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1x0.06mm
Dissecting Spoon	Fine Science Instruments	10370-18