En Optimalisert Prosedyre for fluorescens-aktivert Cell Sorting (FACS) Isolering av Autonome Neural stamfedre fra Visceral organer Fetal Mus

Summary

En optimalisert prosedyre å rense neural crest-avledet nevrale stamceller fra foster mus vev er beskrevet. Denne metoden tar nytte av uttrykk fra fluorescerende reporter alleler å isolere diskrete populasjoner av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Teknikken kan brukes til å isolere nevrale subpopulasjoner gjennom utvikling eller fra voksne vev.

Abstract

Under utviklingen neural crest (NC)-deriverte nevrale stamceller vandrer bort fra nevralrøret å danne autonome ganglier i viscerale organer som tarm og nedre urinveier. Både under utvikling og i modne vev disse cellene er ofte spredt over hele vev slik at isolering av separate populasjoner med metoder som laser capture mikro-disseksjon er vanskelig. De kan imidlertid være direkte visualisert ved uttrykk av fluorescerende reportere fordrevet fra regulatoriske regioner av nervecellen-spesifikke gener som Tyrosin hydroksylase (TH). Vi beskriver en metode optimalisert for høye avlinger av levedyktige TH + nevrale stamceller fra foster mus viscerale vev, inkludert tarmen og nedre urogenitaltractus (LUT), basert på dissosiasjon og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS).

Den Th genet koder hastighetsbegrensende enzym for produksjon av katekolaminer. Enteriske nevrale stamceller begynne å uttrykke TH durbehørig migrasjon i fosterstilling tarmen ¹ og TH er også tilstede i en undergruppe av voksne bekken ganglia nerveceller ^2-4. Den første opptreden i denne avstamning og fordelingen av disse nevronene i andre deler av LUT, og deres isolasjon har ikke blitt beskrevet. Nevrale stamceller uttrykker TH kan være lett visualiseres ved uttrykk av EGFP i mus som bærer transgene konstruktet Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc ^en. Vi avbildes uttrykk for dette transgenet i fosterets mus å dokumentere fordelingen av TH + celler i å utvikle LUT på 15,5 dager etter samleie (DPC), utpeking morgenen av plug påvisning som 0,5 DPC, og observert at en undergruppe av nevrale stamceller i fortetting bekken ganglier ekspress EGFP.

For å isolere LUT TH + nevrale stamceller, optimalisert vi metoder som opprinnelig ble brukt til å rense neural crest stamceller fra foster mus tarmen ^2-6. Tidligere forsøk på å isolere NC-deriverte populasjoner meget pålitelig ifordøyelse med en cocktail av collagenase og trypsin å få cellesuspensjoner for flowcytometri. I våre hender disse metodene produsert cellesuspensjoner fra LUT med relativt lav levedyktighet. Gitt den allerede lave forekomsten av nevrale stamceller i fosterlivet LUT vev, setter vi ut for å optimalisere dissosiasjon metoder slik at celle overlevelse i de endelige dissosierer skulle økes. Vi fastslått at milde dissosiasjon i Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), manuell filtrering, og flyt kildesortering lavtrykkene tillot oss å oppnå gjennomgående større overlevelse (> 70% av totalt antall celler) med påfølgende avkastning av nevrale stamceller tilstrekkelige for nedstrøms analyse. Metoden beskriver vi kan grovt brukes for å isolere en rekke nevronale populasjoner fra enten føtale eller voksen murine vev.

Protocol

1. Utarbeidelse av Media (Alle trinn gjøres i vevskultur hette)

1. Kombiner følgende: 44 ml L-15 Medium, 0,5 ml 100X Penicillin / Streptomycin (P / S), 0,5 ml 100 mg / ml Bovine serum albumin (BSA), 0,5 ml 1M HEPES, 5 ml Tissue Culture gradert vann. Pass på å blande BSA og P / S grundig før du legger. Dette volumet bør være tilstrekkelig for dissosiasjon av opptil fem ulike vev typer. Dette medier vil bli brukt i trinn 3.4 for å forberede slukke løsninger for bruk etter enzymatisk dissosiasjon av vev.
2. Filter Media skjønt 0,22 mikrometer polyetersulfon (PES) filter.
3. Forbered 1X Hank Balanced Salt Solution (HBSS) og 1X Fosfatbufret saltvann (PBS) fra 10X Aksjer med vevskultur karakter vann. Filtrer gjennom 0,22 mikrometer PES filter. Store mengder av disse reagensene kan være forberedt på forhånd og oppbevares ved 4 ° C, aliquoting mindre volumer i en vevskultur hette etter behov.
4. Fyll flere 15 ml koniske rør med 1x HBSS, (Antall rør til lik antallet vev du har tenkt på sub-dissekere) holder rørene på is.

2. Disseksjon

1. Avlive timet gravid mus i samsvar med institusjonell dyr omsorg og bruk Committee godkjente protokoller og overføring livmoren til en 60 eller 100 mm petriskål inneholder iskald 1X PBS.
2. Fjern embryoer fra livmor og avlive ved halshogging i iskaldt 1X PBS. Screen individuelt i henhold fluorescens belysning, dele inn i positive transgene og vill-type (WT) nontransgenic bassenger. Hold embryoer i iskaldt 1X PBS hele disseksjon.
3. Under en dissekere mikroskop, sub-dissekere urogenitaltractus. Hold embryo på plass på forbena nivå med fine tang. Fjern innvollene fra leveren ned til underlivet tuberkel ved å sette tang på nivået av membranen så raskt å trekke de indre organene ned og bort fra dorsal kroppen veggen.
4. Videre sub-dissekere vev avinteresse fra omkringliggende vev (figur 1). Plasser hver individuelt sub-dissekert vevstype til en 15 ml konisk rør som inneholder iskalde 1X HBSS. Pool hver vevstype sammen etter embryo fenotype (dvs. alle GFP + prøver av fosterets tarm er samlet i ett 15 ml konisk tube).
5. Parallelt dissekere sammenlignbare vev fra villtype embryo til bruk for kompensasjon kontroller ved flowcytometri.

3. Dissosiasjon av Subdissected Vev

1. Pellet sub-dissekert vev ved sentrifugering ved 210 relativ sentrifugalkraft (RCF), 4 ° C i 5 min. Etter sentrifugering, aspirer av så mye HBSS som mulig.
2. Resuspender vevet pellet i Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc) Husk å endre pipettespisser mellom hver prøve for å unngå kryss-kontaminering av vevstyper. Mengden av Accumax added kan skaleres for større eller mindre mengder vev. Typisk for en-5 Fosterets tarm prøver, 1 ml Accumax ville bli brukt, men større vev bassenger vil kreve et større volum for å oppnå dissosiasjon.
3. Plasser rør i 37 ° C vannbad for 20-45 min avhengig av stadium av vevet blir isolert (f.eks 13,5 DPC tarmen 20 min, 15,5 DPC tarm 35 min). Halvveis om dissosiasjon tid, manuelt bryte opp vevet ved å banke røret mot siden av vannbad (eller noen fast overflate) og ved "smekke" røret (som man ville riste ned en gammeldags kvikksølv termometer). På slutten av dissosiasjon tiden gjenta riste ned prosedyren flere ganger for å ytterligere distansere prøven. For mer skjøre prøver, redusere vigorousness av shake ned og i stedet bruke pipette trituration i trinn 3.5 for å oppnå et passende nivå av dissosiasjon. Typiske dissosiasjon tider for 14,5 DPC og 15,5 DPC LUT er 35 og 45 min.
4. Mens vev blir ruger i Accumax, sminke slukke såresolusjoner, betegnes Quench og slukke 01:05. Quench lages ved å legge 45 mL 5 mg / ml DNase jeg til 6 ml L-15 Media. Slukk 01:05 lages ved å legge 45 mL 5 mg / ml DNase jeg til 30 ml L-15 Media.
5. Ved utgangen av dissosiasjon, flytter 15 ml rør på is og straks legge til 1 ml quench til hvert rør. Triturate hver prøve opp og ned til vev er nesten helt dissosiert (figur 2). Det vil fortsatt være noen små biter av vev til stede i løsningen. Å oppnå en fullstendig homogen prøve er verken lett oppnåelig eller ønskelig som det kan resultere i dårlig celleviabilitet.
6. Hold prøve på is så mye som mulig for resten av protokollen. Sørg for å bruke en frisk pipettespissen når pipettering opp Quench eller slukke 01:05 for å unngå krysskontaminering av prøvene.

4. Filtrering cellesuspensjon

1. Bruk pinsett som har blitt gjennomvåt i 70% etanol, plasserer en 3 cm kvadrat på 38 mikrometer nylon mesh membran (Sefar Amerika) overmunningen av en ny 15 ml konisk rør. Filter celler gjennom netting med pipettering i sentrum av membran bruke trangere tips. Dersom membranen blir mettet mens filtrering, fjerne den, tørke munnen av røret med en kimwipe, og bruke et nytt stykke av nylon mesh for å filtrere resten av cellesuspensjon. Når alle cellene har blitt filtrert, bruker 1 ml Quench 01:05 å skylle ut røret og filtrere eventuelle gjenværende celler.
2. Når filtrering er fullført, eller når du bytter en tett membran, bruke tang for å rulle opp sidene av mesh og tørk membranen over toppen av røret for å fjerne eventuelle hengende dråper av celler.
3. Pellet cellesuspensjonen ved sentrifugering ved 210rcf, 4 ° C i 5 min. Aspirer av supernatanten og resuspender pellet i 1 ml quench 01:05.
4. Filter cellesuspensjon gjennom nylon mesh i 5 ml polystyren rør. Vask ut 15 ml tube med 1 ml Quench 01:05 og filter for å fange eventuelle gjenværende celler.

5. Klargjøre Prøver for FACS

Hvis du bruker samme vev for sortering og for kompensasjon kontroller, overføre 1/10 ^th til 1 / ^20. av prøven volum til en ny 5 ml polystyren tube å bruke for kompensasjon kontroller. Fordel villtype vevsprøve i to porsjoner. En del vil bli unstained vill-type (WT Only) mens den andre halvparten vil ha 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, et fluoriserende intercalator ekskludert fra levende celler brukt som en "levedyktighet flekk") lagt til den (7-AAD bare ). Disse individuelle kontroller for å tillate erstatning av noen spektrale overlapp mellom utslipp av diskrete fluorophores på flyten sorter. For eksempel, for en enkelt fluorescerende reporter som EGFP, ville nødvendige kontroller inkluderer: EGFP bare, unstained WT celler, og en tube farget med 7-AAD bare (figur 3).

Fyll alle 5 ml rør som inneholder cellesuspensjon med quench 01:05 og sentrifuger ved 210rcf, 4 ° C i 5 min. Aspirer supernatant, etterlot ca 200 mL av væskei rør.

Fortynn 7-AAD 1:1000 i quench 01:05. Legg 7-AAD flekker fortynning til 7-AAD bare kompensasjon kontroll og prøver å bli sortert. Ikke legg 7-AAD til EGFP eneste eller WT bare kompensasjon kontroller. Volum av 7-AAD legges vil variere basert på mengden av start materiale og størrelse cellepelleten innhentet. Når 7-AAD har blitt lagt til egnede rør, prøver er klare til å bli sortert.

Tissue	Eksempel Pool størrelse	Volum 7-AAD å bli lagt til rør *
15.5 DPC Intestine	1-5	200 mL
15.5 DPC LUT	1-5	150 mL

Tabell 1. Mengde 7-AAD lagt til forskjellige vev dissosierer * Den siste totale mengden i hvert rør vil variere med et beløp som spenner 50-100 mL siden aspirasjon av media er enn omtrentlig prosess og utføres for å unngå pellet. Endelige volumer er ikke målt slik minimalisere håndtering av celler i løsning.

Forbered samling rør til fange celler for RNA isolering ved å legge 0,75 ml TRIzol-LS til 1,5 ml Mikrosentrifugerør.

Hvis samle celler for in vitro kultur, snarere enn RNA isolering, sortere celler direkte inn selvfornyelse media i 6 vel vevskulturstudier plater, belagt med fibronectin og fylt med media som tidligere beskrevet. ^2,6,7

6. Flowcytometrisystemer

1. På strømningscytometeret, vurdere kompensasjonen kontrollene første, være sikker på å tilbake spyle mellom hver prøve for å unngå forurensning. Bruk profiler av erstatningsutbetalingene prøver å sette spenning / porter for sortering. Merk at dersom positive celler i vev ønsket er tilstede i begrensende tall, kan en tydelig vev brukes til å etablere kompensasjon innstillinger så lenge fluorescensintensiteten og cellestørrelsemellom prøvene er sammenlignbare.
2. Sett kompensasjon parametere og porter for å unngå døde celler som tar opp 7-AAD fargestoff og samle celler stiller høye intensiteten av GFP fluorescens i forhold til unstained kontroller (figur 4).
3. Sorter maksimalt 25 000 celler i hver mikrosentrifuge rør. Sortering skal utføres på lavest mulig press med et bredt boring dyse og lav strømningshastighet (f.eks 17psi, 100 mikrometer dyse, 3000 events / sek) for å bevare neuronal stamfar levedyktighet. For sorterer å isolere EGFP + celler vi utføre våre isoleringer på en BD Biosciences FACSAriaII med en 488nm 20mW laser for å opphisse EGFP reporter.
4. Dersom prøvene inneholder høye cellekonsentrasjonen, er det tilrådelig å fortynne cellesuspensjon ytterligere hjelp 1:1000 7-AAD beis for å oppnå høyere fangst effektivitet ved sortering.
5. Vortex hvert rør av celler fanget i TRIzol-LS umiddelbart etter sortering.

7. Representative Resultater

Tissue dissosiasjon å produsere en cellesuspensjoner for flow sortering er en hårfin balanse mellom tilstrekkelig enzymatisk fordøyelse og unngå over-fordøyelse som kan resultere i lave celle viabilities. Et eksempel på ønsket nivå av vev dissosiasjon er vist i figur 2. I riktig fordøyd vev før manuelle trituration biter av sub-dissekerte organer er fortsatt tydelig (Figur 2b, 2f). I vev som er enzymatisk behandlet for lenge i en periode eller ved for høy konsentrasjon av enzym, mangler den resulterende suspensjonen gjenværende store biter av vev (figur 2d, 2t).

Passende dissosiasjon og manuell filtrering produsere sortere profiler på flowcytometri som vanligvis stiller større enn 90% levedyktige celler og viser høye nivåer av EGFP uttrykk (figur 4). Celle populasjoner fremstilt ved denne metoden illustrere godlevedyktighet og kan fanges for etterfølgende kultur eller analyse av genuttrykk ved gating for fangst av EGFP + nevrale stamceller.

Figur 1. Fordeling av TH-EGFP + nevrale stamceller i fosterets mus LUT. Hel-mount urogenitaltractus på 15,5 DPC sett ventrally i sterkt felt belysning (a) i forhold til fordeling av EGFP + celler merket med TH-EGFP transgene uttrykk identifisert under fluorescens belysning (b). TH-EGFP uttrykk er til stede i binyrene (a) og medialt plassert cøliaki ganglia (CG). Lateral (c) syn på 15,5 DPC TH-EGFP underkategorier dissekert blære utstillinger fluorescens fra transgene uttrykk i bekkenet ganglier (PG), blæreveggen (BLA) og urinrøret (u). I dorsal visning (d) EGFP + celler er tydelig i fremre dorsal urinrøret. Other labels: nyrene (k), testikkel (t), blære (BLA) og genital tuberkel (GT).

Figur 2. Lysfelt bilder av 15 DPC fosterutvikling LUT (a) og tarm (e), henholdsvis avbildes halvveis gjennom dissosiasjon inkubasjonstiden, på slutten av dissosiasjon inkubasjonstiden før avbrudd (b, f), etter manuell avbrudd (c, g), og i en prøve som har vært altfor dissosiert (d, h).

Figur 3. Prinsippskisse illustrerer kompensasjon styrer for å etablere strenge FACS gating parametere.

Figur 4. Representant bilde av flow sorterer profiler på 14,5 DPS (a) og 15.5 DPS (b). Svart befolkning består av enkeltceller basert på terminrente og side strø som er døde og merket med7-AAD fluorescens. Gray befolkning består av singlet celler basert på fremover og side strø som har ekskludert 7-AAD og er dermed levedyktig. Grønn gated befolkningen er merket med boxed "GFP +" område og består av enkeltceller som har utelukket syv-AAD (levedyktig) og viser EGFP fluorescens.

Discussion

Mus reporter linjer uttrykker fluorescerende reportere blir allment tilgjengelig gjennom flere innsats i murine genetikk samfunnet ^1,8,9. Som et resultat av dissosiasjon metoden illustrert her kan bli mye brukt for isolering av diskrete nevrale undertyper basert på nevrotransmitteren eller reseptor uttrykk mønstre fra enten føtale eller voksen vev. Mens vi har optimalisert denne metoden basert på uttrykk av et fluorescerende transgenet reporter, kan det også brukes til prøver uttrykker reseptorer på celleoverflaten merket med live celle immuno-merking metoder ^3-5,10.

I våre hender observerte vi flere faktorer som påvirket andelen av celler som overlevde dissosiasjon prosedyren. Disse inkluderer medgått tid fra første disseksjon av fostervev til isolering av celler ved flowcytometri, skånsom håndtering av cellesuspensjoner både under filtrering og på flyten sorter, samt enzymet type som brukes i dissociation. Overlevelsen av både enteriske og LUT stamfedre dratt nytte av rask disseksjon / dissosiasjon og bruk av milde forhold under celle sortering (17psi, 100 micron dyse, 3000 events / sek). Vi fant at før isolert på flyten sorter, den totale befolkningen av materiale observert av instrumentet (alle hendelser inkludert rusk og multiplets) generelt utstilt ca 80% overlevelse for celle dissosierer generert enten fra fosteret tarmen eller LUT. Å ekskludere rusk og klumper av celler, innledende porter for forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) ble pålagt denne totale befolkning. Så den totale befolkningen er ytterligere raffinert til en "datter" befolkning av spenningspuls geometri gating for bredde og høyde måling av FSC og SSC å utelukke dubletter. Innenfor dette raffinerte "datteren" befolkning ikke-levedyktige celler som er 7-AAD + ble ekskludert, slik at bare levedyktige celler stiller den fluorescerende EGFP reporteren ble samlet inn. Vi observerte at hyppigheten av overlevelse for nevronale stamceller i denne datteren populasjonen var relativt lavt når dissosiasjon ble utført i en blanding av trypsin + collagenase som rutinemessig brukes i mange tilfeller for dette formål (0,5% Trypsin, Gibco; 10 mg / ml collagenase IV, Worthington) ^{2,5 - 7.} For å oppnå høyere prosentandeler av overlevende nevrale stamceller fra LUT vev isolater, testet vi alternative enzym behandlinger for dissosiasjon av vev å utlede cellesuspensjoner for flyt sortering (tabell 2). Nevrale stamceller utstilt forbedret levedyktighet ved dissosiasjon i dispase (5 mg / ml) en skånsom dissosiasjon metode som ofte brukes for isolering av nevrale rør eller andre nevrale progenitorceller populasjoner ^11. Men observerte størst levedyktighet ble innhentet med Accumax, en proprietær blanding av protease, collagenolytic aktivitet og DNase av ukjente proporsjoner, (tabell 2). Dissosiasjon i Accumax ga det beste overlevelse for begge enteriske nevrale stamceller og LUT neuronal progenitors med beskjedne forskjeller i overlevelse mellom de to kildene. Våre resultater tyder på at forskjellige nevrale populasjoner kan variere i følsomhet sin til dissosiasjon forhold. Derfor bør etterforskerne ønsker å isolere nevrale stamceller eller modne nevroner vurdere dissosiasjon forhold til å identifisere de som produserer den største celle overlevelse og yield for forskjellige vev kilder. Metoden vi beskriver fungerer som et utgangspunkt for slike prosedyrer i det perifere nervesystemet.

Enzym i dissosiasjon løsning	% Overlevelse enteric NP	% Overlevelse LUT NP
Tryp + Collag	29.5 + / - 8,2%, n = 11	46.2 + / - 8,6%, n = 4
Dispase	35.1 + / - 9,8%, n = 10	46.3 + / - 6,6%, n = 9
Accumax	66.5 + / - 7,8%, n = 8	58.1 + / - 5,2%, n = 10

Tabell 2. Livskraftig av nevrale stamceller (NP) i ulike dissosiasjon forhold.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax	Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies)	A7089-100ML	Store frozen in 1 ml aliquots
DNase I	Sigma	D-4527	Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5)
10X PBS pH 7.4	Gibco	70011-044	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
10X HBSS w/o Ca or Mg	Gibco	14185-052	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	21083027
Penicillin /Streptomycin 100X	Gibco	15140-133	Store aliquoted at -20 °C
BSA	Sigma	A3912-100G	Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water
Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl	Lonza	17-737E
38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane	Sefar America	3-38/22	Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood.
7-AAD	Invitrogen	A1310	1 mg/ml
TRIzol LS	Invitrogen	10296-028
5 ml polystyrene tubes	Falcon	352058
15 ml conical tubes	Corning	430790
Fine Dissecting Forceps	Fine Science Instruments	11251-30	Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1x0.06mm
Dissecting Spoon	Fine Science Instruments	10370-18