Una procedura ottimizzata per fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) Isolamento del Sistema Nervoso Autonomo progenitori neurali da organi viscerali di topi fetali

Summary

Una procedura ottimizzata per purificare neurali cresta progenitori neuronali derivate da tessuti fetali del mouse è descritto. Questo metodo sfrutta espressione da alleli reporter fluorescenti per isolare popolazioni discreti fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS). La tecnica può essere applicata per isolare sottopopolazioni neuronali durante lo sviluppo o da tessuti adulti.

Abstract

Durante lo sviluppo cresta neurale (NC) di derivazione progenitori neuronali migrano dal tubo neurale per formare gangli autonomo negli organi viscerali come l'intestino e delle basse vie urinarie. Sia durante lo sviluppo e nei tessuti maturi queste cellule sono spesso disperse in tutta tessuti in modo che l'isolamento delle popolazioni discrete mediante metodi come la cattura laser micro-dissezione è difficile. Possono comunque essere visualizzati direttamente tramite l'espressione di giornalisti fluorescenti guidati da regioni regolatorie dei geni specifici neuroni, come la tirosina idrossilasi (TH). Noi descriviamo un metodo ottimizzato per alte rese di + TH vitale progenitori neuronali da tessuti di topo fetali viscerali, inclusi intestino e inferiore del tratto urogenitale (LUT), basata su fluorescenza dissociazione e selezione delle cellule attivate (FACS).

Il gene codifica per la Th enzima limitante per la produzione di catecolamine. Enterici progenitori neuronali cominciano a esprimere TH durcorso del loro migrazione nell'intestino fetale ¹ e TH è anche presente in un sottoinsieme di adulti neuroni gangli pelvico ^2-4. La prima comparsa di questa linea e la distribuzione di questi neuroni in altri aspetti della LUT, e il loro isolamento non è stata descritta. Progenitori neuronali che esprimono TH possono essere facilmente visualizzati tramite espressione di EGFP in topi portatori del transgene costrutto Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc ^1. Abbiamo ripreso espressione di questo transgene nei topi fetali per documentare la distribuzione dei TH + celle nella LUT sviluppando a 15,5 dopo il coito giorni (DPC), che designa la mattina del rilevamento Plug come 0,5 DPC, e ha osservato che un sottoinsieme di progenitori neuronali nel coalescenza pelvica gangli express EGFP.

Per isolare LUT TH + progenitori neuronali, abbiamo ottimizzato metodi che sono stati inizialmente utilizzati per purificare le cellule della cresta neurale staminali da intestino del mouse fetale ^2-6. Sforzi precedenti per isolare NC-derivati ​​popolazioni invocatidigestione con un cocktail di collagenasi e tripsina per ottenere sospensioni cellulari per citometria a flusso. Nelle nostre mani questi metodi di sospensioni di cellule prodotte dal LUT con la vitalità relativamente bassa. Data la già bassa incidenza dei progenitori neuronali nei tessuti fetali LUT, abbiamo deciso di ottimizzare i metodi di dissociazione tali che la sopravvivenza delle cellule si dissocia in finale sarebbe aumentato. Abbiamo determinato che la dissociazione dolce in Accumax (Cell Technologies innovative, Inc), manuale di filtraggio, e il flusso di smistamento a basse pressioni ci hanno permesso di ottenere la sopravvivenza sempre maggiore (> 70% delle cellule totali) con rese successivi di progenitori neuronali sufficiente per l'analisi a valle. Il metodo che descriviamo può essere generalmente applicato a isolare una varietà di popolazioni di neuroni da entrambi i tessuti fetali o adulto di topo.

Protocol

1. Preparazione di Media (Tutte le fasi fatto in cappa di coltura di tessuti)

1. Combina il seguente: 44 L-15 ml media, 0,5 ml 100X penicillina / streptomicina (P / S), 0,5 ml 100 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA), 0,5 ml HEPES 1M, 5 ml di acqua Tissue Culture Grade. Assicurarsi di mescolare BSA e P / S bene prima di aggiungere. Questo volume dovrebbe essere adeguato per la dissociazione di un massimo di cinque tipi diversi tessuti. Questo supporto sarà utilizzato nel passaggio 3,4 per preparare le soluzioni di raffreddamento rapido per l'uso dopo dissociazione enzimatica del tessuto.
2. Media filtrante sebbene 0,22 micron polieteresulfone (PES) del filtro.
3. Preparare la soluzione Balanced Salt 1X Hank (HBSS) e fosfato 1X Buffered Saline (PBS) provenienti dalle scorte di 10X usando cultura dell'acqua dei tessuti di qualità. Filtrare su filtro 0,22 micron PES. Grandi volumi di questi reagenti possono essere preparate in anticipo e conservato a 4 ° C, aliquotando piccoli volumi in una cappa coltura tissutale come necessario.
4. Riempire più provette da 15 ml coniche con 1x HBSS (numero di tubi per eguagliare il numero di tessuti si ha intenzione di sub-dissezione), mantenendo i tubi su ghiaccio.

2. Dissezione

1. Eutanasia cronometrato del mouse in stato di gravidanza in conformità con la cura degli animali istituzionali e protocolli delle commissioni di utilizzo autorizzati e trasferimento in utero di 60 o 100 mm Petri contenente ghiacciata 1X PBS.
2. Rimuovere embrioni da utero e l'eutanasia per decapitazione in ghiacciato 1X PBS. Schermo individualmente sotto l'illuminazione a fluorescenza, dividendosi in positivo transgenici e wild-type (WT) nontransgenic piscine. Mantenere gli embrioni in ghiacciato 1X PBS in tutta la dissezione.
3. Sotto un microscopio da dissezione, sub-sezionare il tratto urogenitale. Tenere l'embrione in atto a livello degli arti anteriori con pinze sottili. Rimuovere il visceri dal fegato fino al tubercolo genitale inserendo pinza a livello del diaframma poi bruscamente tirando gli organi interni basso e lontano dalla parete del corpo dorsale.
4. Ulteriori sub-sezionare il tessuto diinteresse dal tessuto circostante (Figura 1). Collocare ciascuna singolarmente sub-sezionato tipo di tessuto in una provetta da 15 ml contenente ghiaccio HBSS freddo 1X. Pool ogni tipo di tessuto insieme secondo fenotipo embrionale (ossia tutte le GFP + campioni di intestino fetale sono raggruppate in un unico tubo 15 ml).
5. In parallelo, sezionare i tessuti comparabili da wild-type embrioni da utilizzare per i controlli di compensazione in citometria a flusso.

3. La dissociazione dei tessuti Subdissected

1. Pellet sub-sezionato tessuto mediante centrifugazione a 210 centrifuga relativa (RCF), 4 ° C per 5 min. Dopo la centrifugazione, aspirare fuori come HBSS il più possibile.
2. Risospendere il precipitato di tessuto in Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), avendo cura di cambiare puntali per pipette tra ciascun campione per evitare la contaminazione incrociata dei tipi di tessuto. La quantità di Accumax aggiunto può essere scalato per quantità maggiori o minori di tessuto. Tipicamente per 1-5 Campioni dell'intestino fetale, 1 ml di Accumax verrebbe utilizzato ma piscine tessuto più grandi richiedono un maggior volume per ottenere dissociazione.
3. Porre le provette 37 ° C in bagno d'acqua per 20-45 min a seconda fase del tessuto che viene isolato (per es 13,5 intestino DPC 20 min, 15,5 intestino DPC 35 min). A metà se il tempo dissociazione, manualmente rompere il tessuto battendo il tubo contro il lato del bagno d'acqua (o qualsiasi superficie solida) e da "sfogliare" il tubo (come si shake down un vecchio termometro a mercurio). Alla fine del tempo di dissociazione ripetere la shake giù operazione più volte per dissociare ulteriormente il campione. Per i campioni più fragili, ridurre il vigorousness del shake down e di utilizzare invece triturazione pipetta durante il Passo 3,5 per raggiungere un adeguato livello di dissociazione. I tempi tipici di dissociazione per 14,5 e 15,5 DPC DPC LUT sono 35 e 45 min, rispettivamente.
4. Mentre il tessuto è in incubazione Accumax, make up Quenching cosìluzioni, chiamato Quench e Quench 1:5. Quench è fatto con l'aggiunta di 45 microlitri 5 mg / ml DNasi I a 6 ml L-15 Media. Quench 01:05 è fatta con l'aggiunta di 45 microlitri 5 mg / ml DNasi I 30 ml L-15 Media.
5. Alla fine di dissociazione, spostare provette da 15 ml su ghiaccio e subito aggiungere 1 ml Quench in ciascun tubo. IMPASTARE ciascun campione su e giù finché il tessuto è quasi completamente dissociato (Figura 2). Ci saranno ancora alcuni piccoli pezzi di tessuto presente nella soluzione. Il raggiungimento di un campione del tutto omogeneo non è né facilmente realizzabile né auspicabile in quanto può portare a scarsa vitalità delle cellule.
6. Mantenere campione su ghiaccio per quanto possibile per il resto del protocollo. Assicurarsi di utilizzare un nuovo puntale per pipetta quando pipettando su Quench o Quench 01:05 per evitare la contaminazione incrociata dei campioni.

4. Filtraggio sospensione cellulare

1. Utilizzo di pinze che sono stati immersi in 70% etanolo, posizionare un 3 cm quadrati di 38 um membrana maglia di nylon (Sefar America) sulla bocca di un nuovo tubo di 15 ml. Celle filtranti attraverso la rete pipettando nella centro della membrana usando punte strette foro. Se la membrana si satura mentre filtraggio, rimuoverlo, asciugare la bocca del tubo con un Kimwipe, e utilizzare un nuovo pezzo di maglia di nylon per filtrare il resto della sospensione cellulare. Una volta che tutte le cellule sono stati filtrati, usare 1 ml Quench 1:5 a sciacquare il tubo e filtrare tutte le cellule rimanenti.
2. Quando il filtro è completa, o quando si sostituisce una membrana intasato, utilizzare forcipe per arrotolare i lati della maglia e pulire la membrana attraverso superiore del tubo per rimuovere eventuali gocce di cellule sospese.
3. Pellet sospensione cellulare mediante centrifugazione a 210rcf, 4 ° C per 5 min. Aspirare off surnatante e risospendere pellet in 1 ml Quench 1:5.
4. Sospensione cellulare attraverso il filtro rete di nylon in 5 provette di polistirene ml. Lavare tubo di 15 ml con 1 ml Quench 1:5 e filtro per catturare tutte le cellule rimanenti.

5. Preparazione dei campioni per FACS

Se si utilizza lo stesso tessuto per l'ordinamento e per i controlli di compensazione, trasferire 1/10 ^° a 1/20 del volume ^esimo campione ad un nuovo tubo 5 ml polistirene da utilizzare per i controlli di compensazione. Dividere il wild-type campione di tessuto in due parti. Una parte viene macchiata di tipo selvatico (WT solo) mentre la seconda metà avrà 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, un intercalatore fluorescente escluso dalle cellule vivi utilizzati come "viabilità macchia") aggiunto ad esso (7-AAD solo ). Questi singoli controlli sono necessari per consentire la compensazione di eventuali sovrapposizioni tra le spettrali emissione di fluorofori discreti al selezionatore di flusso. Ad esempio, per un reporter fluorescente come EGFP, necessari controlli dovrebbe includere: EGFP solo, non marcate cellule in peso, e un tubo colorato con 7-AAD solo (figura 3).

Riempire tutte le provette da 5 ml contenenti sospensione cellulare con Quench 1:5 e centrifugare a 210rcf, 4 ° C per 5 min. Aspirare il surnatante, lasciando circa 200 ul di liquidoin provetta.

Diluire 7-AAD 1:1000 in Quench 1:5. Aggiungi 7-AAD diluizione colorazione a 7-AAD controllo della compensazione solo e campioni da ordinati. Non aggiungere 7-AAD alla EGFP solo o WT controlli di compensazione solo. Volume di 7-AAD da aggiungere variano in base alla quantità di materiale di partenza e dimensione del pellet cellulare ottenuto. Dopo 7-AAD è stato aggiunto a tubi appropriati, i campioni sono pronti per essere ordinati.

Tessuto	Esempio Pool Size	Volume 7-AAD da aggiungere * provetta
15,5 DPC Intestino	1-5	200 pl
15,5 DPC LUT	1-5	150 pl

Tabella 1. Quantità di 7-AAD aggiunto dissocia tessuti diversi * l'ammontare totale finale in ciascun tubo varia da una quantità variabile dal 50-100 pl poiché l'aspirazione di media è unn processo approssimativo ed eseguito per evitare il pellet. Volumi finali non sono misurate in modo da minimizzare la manipolazione di cellule in soluzione.

Preparare le provette di raccolta per catturare le cellule per l'isolamento di RNA con l'aggiunta di 0,75 ml TRIzol-LS ai tubi microcentrifuga 1,5 ml.

Se la raccolta di cellule per la coltura in vitro, anziché isolamento RNA, cellule ordinamento direttamente in automantenimento media in piastre da 6 pozzetti di coltura, rivestito con fibronectina e riempito con mezzi come descritto in precedenza. ^2,6,7

6. Citometria a Flusso

1. Al citofluorimetro, valutare la compensazione controlli prima, avendo cura di lavare di nuovo tra ciascun campione per evitare la contaminazione. Utilizzare i profili dei campioni di compensazione per impostare tensioni / cancelli per l'ordinamento. Si noti che se le cellule positive nel tessuto desiderato sono presenti in numero di limitazione, un tessuto distinto può essere utilizzato per stabilire le impostazioni di compensazione finché l'intensità di fluorescenza e la dimensione della cellatra i campioni sono paragonabili.
2. Impostare i parametri di compensazione e cancelli per evitare le cellule morte che occupano 7-AAD dye e raccogliere le cellule che presentano alta intensità di fluorescenza GFP rispetto ai controlli non colorati (Figura 4).
3. Ordinare massimamente 25.000 cellule in ciascuna provetta. L'ordinamento deve essere effettuata presso la pressione più bassa possibile con un ugello largo foro e bassa portata (ad esempio, 17psi, 100 ugelli um, 3000 eventi al secondo) per preservare la vitalità neuronale progenitore. Per i tipi di isolare le cellule EGFP + svolgiamo le nostre isolamenti su un BD Biosciences FACSAriaII utilizzando un laser 488nm 20mW per eccitare il reporter EGFP.
4. Se i campioni di cellule contengono concentrazioni elevate, si consiglia di diluire la sospensione cellulare inoltre, si avvale 1:1000 7-AAD macchia per raggiungere efficienze di cattura più elevati durante l'ordinamento.
5. Vortex ogni provetta delle cellule catturato in TRIzol-LS subito dopo l'ordinamento.

7. Risultati rappresentativi

Tissue dissociazione per produrre un sospensioni cellulari per l'ordinamento di flusso è un delicato equilibrio tra adeguata digestione enzimatica ed evitare l'eccessiva digestione che può portare a Viabilità di cellule basse. Un esempio di tessuto desiderato livello di dissociazione è mostrato in Figura 2. Nel tessuto opportunamente digerito pezzi prima triturazione manuali di organi sub-sezionati sono ancora ben evidente (Figura 2b, 2f). In tessuti che vengono trattate enzimaticamente per troppo tempo un periodo di tempo o eccessivamente alta concentrazione di enzima, la sospensione risultante manchino pezzi residui grandi quantità di tessuto (figura 2d, 2h).

Adeguata dissociazione e filtraggio manuale produrre profili di ordinamento in citometria a flusso che mostrano tipicamente superiore al 90% di cellule vitali e mostrano alti livelli di espressione di EGFP (Figura 4). Popolazioni cellulari ottenuti con questo metodo illustrano beneeconomico-finanziaria e può essere catturata per la cultura o la successiva analisi dell'espressione genica mediante gating per la cattura di EGFP + progenitori neuronali.

Figura 1. Distribuzione dei TH-EGFP + progenitori neuronali LUT del mouse fetale. Whole-mount tratto urogenitale a 15.5 dpc visto ventralmente sotto illuminazione in campo chiaro (a) rispetto alla distribuzione delle cellule EGFP + etichettati da TH-EGFP espressione del transgene identificato con l'illuminazione a fluorescenza (b). TH-EGFP espressione è presente in ghiandole surrenali (a) e nei gangli celiaco trova medialmente (cg). Laterale (c) vista di 15,5 DPC TH-EGFP sotto-sezionati mostre vescica fluorescenza da espressione del transgene nei gangli pelvica (pg), la parete della vescica (bla) e l'uretra (u). In vista dorsale (d) EGFP celle + sono evidenti nell'uretra anteriore dorsale. Altre etichette: reni (k), del testicolo (t), della vescica (bla) e tubercolo genitale (gt).

Figura 2. Immagini brightfield del 15 LUT DPC fetale (a) e intestino (e), rispettivamente, ripresa metà del periodo di incubazione dissociazione, alla fine dell'incubazione dissociazione prima interruzione (b, f), dopo la rottura manuale (c, g), e in un campione che è stato troppo dissociata (d, h).

Figura 3. Schema illustra compensazione controlli necessari per stabilire rigorosi parametri di gating FACS.

Figura 4. Immagine rappresentativa di profili di ordinamento di flusso a 14,5 DPC (a) e 15,5 DPC (b). Popolazione di colore è composta da singole cellule basate sulla dispersione in avanti e laterale che sono morti ed etichettati da7-AAD fluorescenza. Grigio popolazione è composta da cellule di singoletto a base di scatter in avanti e laterale che hanno escluso 7-AAD e sono quindi vitali. Verde popolazione gated è indicato dal box "GFP +" area ed è costituito da singole celle sono esclusi 7-AAD (vitale) e presentano fluorescenza EGFP.

Discussion

Linee giornalista del mouse che esprimono giornalisti fluorescenti sono sempre ampiamente disponibili attraverso molteplici sforzi nella genetica murina comunità ^1,8,9. Come risultato il metodo dissociazione illustrato qui può essere ampiamente utilizzato per l'isolamento di distinti sottotipi neuronali basato su neurotrasmettitore o pattern di espressione del recettore da entrambi i tessuti fetali o adulto. Mentre ci sono ottimizzate questo metodo basato su espressione di un reporter fluorescente transgene, può anche essere applicata a campioni che esprimono recettori della superficie cellulare di cellule marcate con vivi immuno-etichettatura metodi ^3-5,10.

Nelle nostre mani abbiamo osservato diversi fattori che colpite la percentuale di cellule che sono sopravvissute alla procedura di dissociazione. Questi includono il tempo trascorso da dissezione iniziale di tessuto fetale di isolamento di cellule mediante citometria a flusso, manipolazione delicata di sospensioni di cellule, sia durante la filtrazione e il selezionatore di flusso, nonché il tipo di enzima usato in dissociation. La sopravvivenza di entrambi i progenitori enterici e LUT beneficiato dalla dissezione rapida / dissociazione e l'uso di condizioni di dolci durante la selezione delle cellule (17psi, 100 ugelli micron, 3.000 eventi / sec). Abbiamo trovato che prima dell'isolamento al selezionatore di flusso, la popolazione totale di materiale osservata dallo strumento (tutti gli eventi compresi detriti e multipletti) generalmente mostravano circa 80% di sopravvivenza per le cellule dissocia generati sia da intestino fetale o LUT. Per escludere detriti e gruppi di cellule, porte iniziali per forward scatter (FSC) e lato scatter (SSC) sono state inflitte a questa popolazione totale. Poi la popolazione totale è ulteriormente raffinato per una popolazione "figlia" di gating geometria impulsi di tensione per la larghezza e l'altezza misura di FSC e SSC per escludere doppietti. All'interno di questa raffinata popolazione "figlia" non vitali cellule che sono 7-AAD + sono stati esclusi in modo che solo le cellule vitali che esibiscono la reporter fluorescente EGFP sono stati raccolti. Abbiamo osservato che la frequenza di sopravvivenza per neuroprogenitori nali in questa popolazione la figlia è stata relativamente bassa quando dissociazione è stata eseguita in una miscela di collagenasi tripsina + che viene utilizzato di routine in molti casi, per questo scopo (0,5% tripsina, Gibco; 10 mg / ml Collagenasi IV, Worthington) ^{2,5 - 7.} Per ottenere maggiori percentuali di sopravvivenza progenitori neuronali isolati da tessuto LUT, abbiamo testato alternativi trattamenti enzimatici per la dissociazione del tessuto per derivare sospensioni cellulari di smistamento del flusso (Tabella 2). Progenitori neuronali esposto efficienza migliorata dissociazione in dispasi (5 mg / ml) un metodo dolce dissociazione che viene spesso usato per l'isolamento di tubi o di altre popolazioni neuronali progenitrici neurali ^11. Tuttavia, la maggiore redditività osservata è stata ottenuta con Accumax, una miscela di proteasi, l'attività collagenolitica e DNasi di proporzioni sconosciute, (Tabella 2). Dissociazione in Accumax prodotto la migliore sopravvivenza per entrambi i progenitori neuronali enterici e LUT neuronale progenitors con differenze modeste in termini di sopravvivenza tra le due fonti. I nostri risultati suggeriscono che diverse popolazioni di neuroni possono differire nella loro sensibilità alle condizioni di dissociazione. Così, gli investigatori cercano di isolare progenitori neuronali o neuroni maturi, valutare le condizioni di dissociazione per identificare quelli che producono la sopravvivenza delle cellule e la resa massima per le fonti dei tessuti distinti. Il metodo descriviamo serve come punto di partenza per tali procedure nel sistema nervoso periferico.

Enzima in soluzione dissociazione	% NP sopravvivenza Enteric	% Di sopravvivenza LUT NP
Tryp + Collag	29,5 + / - 8,2%, n = 11	46,2 + / - 8,6%, n = 4
Dispasi	35,1 + / - 9,8%, n = 10	46,3 + / - 6,6%, n = 9
Accumax	66,5 + / - 7,8%, n = 8	58,1 + / - 5,2%, n = 10

Tabella 2. Vitalità di cellule progenitrici neuronali (NP) in diverse condizioni di dissociazione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumax	Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies)	A7089-100ML	Store frozen in 1 ml aliquots
DNase I	Sigma	D-4527	Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5)
10X PBS pH 7.4	Gibco	70011-044	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
10X HBSS w/o Ca or Mg	Gibco	14185-052	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	21083027
Penicillin /Streptomycin 100X	Gibco	15140-133	Store aliquoted at -20 °C
BSA	Sigma	A3912-100G	Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water
Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl	Lonza	17-737E
38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane	Sefar America	3-38/22	Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood.
7-AAD	Invitrogen	A1310	1 mg/ml
TRIzol LS	Invitrogen	10296-028
5 ml polystyrene tubes	Falcon	352058
15 ml conical tubes	Corning	430790
Fine Dissecting Forceps	Fine Science Instruments	11251-30	Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1x0.06mm
Dissecting Spoon	Fine Science Instruments	10370-18