El-Free, Sekventiel Nucleic Acid og protein isolering

Summary

Et værktøj og kemier er beskrevet til sekventielt isolere nukleinsyrer efterfulgt af proteiner fra en prøve uden behov for elektricitet. Værktøjet består af en sorbent holdes i en overførsel pipette, mens isolering kemiske er baseret på fastfase-ekstraktion principper. De isolerede makromolekyler kan analyseres ved immuno-baserede og PCR-baserede assays.

Abstract

Traditionelle og nye patogener såsom enterohæmoragisk Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, eller prion-baserede sygdomme er af stor bekymring for regeringer, industrier og læger verden over. For eksempel er EHECs kombineret med Shigella og ansvarlig for dødsfald på omkring 325.000 børn hvert år, og er særligt udbredt i udviklingslandene, hvor laboratorie-baseret identifikation, udbredt i USA, er ikke tilgængelig ^1. Den udvikling og distribution af lave omkostninger, kan felt-baserede, point-of-care værktøjer til at hjælpe med hurtig kortlægning og / eller diagnose af patogener eller sygdomme markører dramatisk ændre sygdomsprogression og patient prognose. Vi har udviklet et værktøj til at isolere nucleinsyrer og proteiner fra en prøve ved fastfase-ekstraktion (SPE) uden elektricitet eller tilhørende laboratorieudstyr ^2. De isolerede makromolekyler kan anvendes til diagsis enten i fremadgående laboratorium eller ved hjælp af felt-baserede point-of-care platforme. Vigtigere er denne fremgangsmåde tilvejebringer direkte sammenligning af nukleinsyre og protein data fra en ikke-spaltet prøve giver en statistisk ved bekræftelse af genomiske og proteomik analyse.

Vores isoleret værktøj anvender standard for fastfase-nukleinsyre isoleret BOOM teknologi, som isolerer nukleinsyrer fra et chaotropt salt-opløsning, sædvanligvis guanidinisothiocyanat, ved binding til silica-baserede partikler eller filtre ^3. CUBRC navnebeskyttede fastfase-ekstraktion kemi anvendes til at oprense proteinet fra chaotrope saltopløsninger, i dette tilfælde fra affald eller flow-igennem efter nukleinsyreisolering ^4.

Ved emballering velkarakteriseret kemier i en lille, billig og enkel platform har vi skabt en bærbart system til nukleinsyre og protein ekstraktion, som kan udføres under en variety betingelser. De isolerede nukleinsyrer er stabile og kan transporteres til en stilling, hvor strømmen er til rådighed for PCR-amplifikation, medens proteinindholdet umiddelbart kan analyseres ved håndholdt eller andre immunologiske assays. Den hurtige identifikation af sygdom markører i området i væsentlig grad kan ændre patientens resultat ved at dirigere den rette løbet af behandlingen på et tidligere stadium af sygdomsprogression. Værktøjet og fremgangsmåden beskrevet er egnede til anvendelse med praktisk talt enhver infektiøse agens og giver brugeren redundans af multi-makromolekylet typen analyser og samtidig reducere deres logistiske belastning.

Protocol

1. Sample Lysis

1. Prøver bør være i flydende form. Hvis prøven er fast, for eksempel fødevarer eller afføring, skal prøven suspenderet i et flydende medium, såsom vand eller phosphatbufret saltvand (PBS).
2. Bland 500 pi af prøven med 500 pi 6M guanidin-thiocyanat (pH 6,5) i et 1,5 ml rør.
3. Tryk pæren af ​​et udtræk pipette, udvise den omgivende luft.
4. Trække hele 1 ml prøve ind i ekstraktionsrøret pipetten over sorbentmaterialet ved at tillade pæren langsomt ekspandere.
5. Vend udtræk værktøj, således at sorbentperler og prøve løbe ned i pæren.
6. Mal sorbentperler med prøven i pæren være omhyggelig med ikke at udvise prøven ud af udvinding pipetten.

2. Nucleic Acid Ekstraktion (fig. 1, panel A)

1. Inverterer ekstraktion pipetten (åbne nedad) og udstøde prøven i den oprindelige 1,5 ml rør.
<li> trække hele 1 ml prøve ind i ekstraktionsrøret pipetten, passerer over adsorbenten, ved en moderat hastighed, er omhyggelig med at holde sorbenten i halsen af ​​ekstraktionen pipette.
2. Uddrive hele prøven i 1,5 ml rør ved at nedtrykke pæren.
3. Gentage trin 2.2 og 2.3 lede prøven i løbet af de sorberende fire gange i i alt 5 passerer.
4. Efter den femte passage over adsorbenten, hele 1 ml prøve udvise i 4 ml af proteinet ekstraktionsbuffer (i et 15 ml konisk rør), lukke røret, og der er afsat til senere brug.
5. Vask de isolerede nukleinsyrer ved at lede 1 ml 95% ethanol i løbet af de sorberende tre gange, returnerer ethanol til sin oprindelige rør ved endelig passage.
6. Gentage trin 2,6 under anvendelse af en anden 1 ml 95% ethanol-vaskevæsken.
7. Tryk og frigive pære i 5 minutter, passerer luften gennem ekstraktion pipetten at tørre nukleinsyrerne / sorbentlejet. Tør resterende ethanol fra spidsen af ​​ekstraktionen pipetten usynge en Kimwipe.
8. Gendanne nukleinsyrer ved at passere 250 pi 10 mM Tris (pH 6,8) i løbet af de sorberende fem gange. Tris-puffer kan erstattes af enhver anden egnet vandig opløsning, såsom PBS. Den resulterende opløsning indeholder de ekstraherede nukleinsyrer.

3. Proteinekstraktion (fig. 1, panel B)

1. Prøven blandes og proteinekstraktion bufferrøret fra trin 2,5 ved inversion og passerer omkring 02:58 ml af denne 5 ml prøve over adsorbenten for en ny ekstraktion pipette.
2. Uddrive hele prøven i de samme 15 ml konisk rør og holdes sorbenten i halsen af ​​ekstraktionen pipette.
3. Gentage trin 3.1 og 3.2, lede prøven gennem sorbent 15 gange.
4. Vask sorbenten og det bundne protein ved at lede 1 ml 95% ethanol i løbet af sorbentlejet tre gange udstøde ethanol i det oprindelige rør.
5. Gentage trin 3,4 under anvendelse af en anden 1 ml 95% ethanol-vaskevæsken.
6. Tryk og frigive pære i 5 minutter, passerer luften gennem ekstraktion pipetten at tørre proteinet / sorbentlejet. Tør resterende ethanol fra spidsen af ​​ekstraktionen pipetten ved hjælp af en Kimwipe.
7. Genvinde proteinet ved at lede 250 pi PBS de sorberende fem gange. PBS-buffer kan erstattes af enhver anden egnet vandig opløsning, såsom 10 mM Tris (pH 6,8). Den resulterende opløsning indeholder proteinindholdet i prøven.

Figur 1.

Figur 2.

Figur 3.

Figur 4.

indhold ">
Figur 5.

Representative Results

Nukleinsyreisolationsfremgangsmåder: Isolerede nucleinsyrer er PCR amplificerbare og fri for protein kontaminering.

Eksempel 1: De udvundne nucleinsyrer er egnede til anvendelse i PCR-baserede applikationer. For eksempel viser figur 2 amplifikation af Shiga-toksin-gener associeret med enterohæmoragisk E. coli O157: H7-stamme EDL-933 (ATCC # 35.150) fra en nukleinsyre / protein ekstraktion under anvendelse af ekstraktion pipetten. For Shiga-toksin-gener STX 1 og stx 2 findes på tempereret lambda-lignende bakteriofag og defekte bakteriofag i denne og andre enterohæmoragisk E. coli-stammer under kontrol af P _R promotoren ^{5 6 7 8.} Aktivering af SOS respons i E. coli medfører profag induktion og / eller toksiner ^9. Vi har anvendt en modificeret version af det multipleksede PCR-assay af Feng et al. ^En1 for at identificere STX 1 og STX 2-gener i både kultur og spiked spildevand prøver. Banerne A og B i figur 2 viser resultaterne af en PCR-amplifikation af en ubehandlet kultur prøve (bane A) og en behandlet kultur prøve (bane B). Disse resultater er næsten identiske betyder at der er noget tab af nøjagtighed i de behandlede eller isolerede nukleinsyrer. Dernæst amplificerede tilsat fækalierne (bane D) eller isolerede nukleinsyrer fra spiked spildevand (bane E & F). Disse data indikerer, at de isolerede nukleinsyrer resulterede i større forstærkning i forhold til de ikke-isolerede nukleinsyrer fra spiked spildevand prøver. Vi konkluderer derfor, at enten PCR-inhibitorer, der findes naturligt i spildevandet blev fjernet efter isolering eller nukleinsyrerne blev koncentreret efter isolering. En kombination af disse to situationer er også mulig.

Ultraviolet spektroskopi blev dernæst anvendt til at vise, at de isolerede nukleinsyrer var relativt fri of kontaminerende protein. Figur 3 viser UV-spektre af to E. coli O157: H7 nukleinsyre ekstraktioner, mærket isolation a og isolation b, i sammenligning med den normaliserede spektrum af bakteriekulturen, mærket præ-isolation. UV-spektre af de isolerede nukleinsyrer ligner spektret af rene nukleinsyrer, der har en beregnede forhold af absorbans mellem 260 nm og 280 nm, der nærmer sig 1,8 ^10. Disse data viser, at der er meget lidt kontaminerende proteiner i nucleinsyren fraktion med den beskrevne teknik.

Proteinisolering: udvundne protein fra nukleinsyren / proteinisolering eksperiment er immunoreaktive og elektroforetisk identisk med rent protein.

Eksempel 2: Det isolerede protein-fraktion blev påført til RapidChek E. coli O157 lateral-flow assay strimler (SDIX, Inc.). Controls viser en positiv identifikation i alle prøver huser E. coli O157, med eller uden STX induktion (fig. 4, bane B og C henholdsvis). Dataene i Figur 4 viser også positive resultater for disse prøver husende E. coli O157 der blev behandlet for nukleinsyrer og derefter protein ved ekstraktion pipetten. Disse data viser, at det isolerede protein fra hver prøve er immunoreaktivt således udløser et positivt respons.

PCR-amplifikation (som beskrevet i eksempel 1) blev udført på de proteinprøver at vise, at det isolerede protein fraktion var blottet for kontaminerende nukleinsyrer. Resultaterne for disse forsøg var alle negative ved gelelektroforese. Således har vi konkludere, at proteinindholdet i prøven blev separeret fra kontaminerende nukleinsyrer. Disse resultater taget i hele med dem beskrevet for isolering af nukleinsyre trin viser, at nukleinsyrerne og proteinindhold isoleres i separate fraktioneringstrin.

t "> Eksempel 3:. Det isolerede protein er egnet til elektroforese ¹⁰ 5 viser en Coomassie-farvet 8% acrylamidgel fyldt med BSA (fig. 5, bane A og C) og BSA isoleret fra 6M guanidin-isothiocyanat ved hjælp af ekstraktion pipette og tilknyttede protokol. Den elektroforetiske mobilitet af det isolerede protein er identisk med kontrolprøverne. Vi har således konkluderes, at ekstraktionsprocessen ikke ændrer den kovalente struktur af det isolerede protein.

Figur 1, panel A: afbildning af en typisk nukleinsyre ekstraktionsprocedure Prøven blandes med 6M guanidin thiocyanat i prøveglasset, og passeret over de sorberende fem gange.. Efter den sidste passage, sættes prøven til protein ekstraktionsbuffer. Adsorptionsmidlet og bundne nukleinsyrer vaskes to gange med ethanol. Prøven er derefter luft dRied og elueres fra adsorbenten.

Figur 1, panel B: afbildning af en typisk protein ekstraktionsprocedure Prøven blandes med proteinisolering buffer fra trin 1, figur 1, panel A ledes over adsorbenten af en anden ekstraktion pipette 15 gange.. Resten af ​​proceduren er identisk med nukleinsyren ekstraktion protokol.

Figur 2:. Negativt billede af en ethidiumbromidfarvet agarosegel et multiplekset shigatoksin 1 og 2 genamplifikation eksperiment blev udført under anvendelse kulturprøver (bane A og B) eller fækalierne prøver tilsat E. coli O157: H7 (bane D, E og F). Prøverne blev enten tilsættes direkte til et PCR-reaktionsrør (bane A og D) eller prøver blev behandlet ved anvendelse af isolation process og de ekstraherede nukleinsyrer blev tilsat til PCR-reaktionen røret (prøverne B, E og F). PCR-protokol er en modifikation af den beskrevet af Feng et al ^11. Vores ændring målrettet kun dem, forstærkes af STX 1 (nedre bånd) og STX 2 (øvre bånd) primerpar, forlader alle andre primerpar. Bane C er 1 kb stige fra BioRad.

Figur 3: UV-spektroskopi resultater E. coli O157: H7 nucleinsyrer isoleret under anvendelse af rapporterede ekstraktion pipetten De isolerede nukleinsyrer er mærket isolation a og isolation b... UV-spektret af prøven blev også testet forud for ekstraktion af nukleinsyrer og er mærket præ-isolation. Spektrene blev opnået under anvendelse af en Hitachi U3010 spektrofotometer og tilhørende software-pakke.

Figur 4:. Farve billede af RapidChek teststrimler Proteinindholdet af prøverne anvendt i figur 2 blev isoleret under anvendelse af ekstraktion pipette og testet for immunreaktivitet med lateral-flow assay. Banerne AC er uforarbejdede kontroller, som er blev cellekultur tilsat til teststrimlen uden nukleinsyren eller proteinet ekstraktion. Bane A er E. coli BL21 DE3 pLysS som en negativ kontrol, bane B og C viser E. coli O157: H7, som var ubehandlede (B) eller behandlet med mitomycin C i 4 timer (C). Bane D til H viser resultaterne af tilsætning af ekstraherede protein til lateral-flow teststrimler. Bane D og E blev probet under anvendelse proteinekstrakt fra E. coli BL21 DE3 pLysS enten uden (D) eller med mitomycin C-behandling (E) som negative kontroller. Lanes FH viser resultaterne, når udvundet protein fra E. coli O157: H7 blev anvendt. Protein blev ekstraheret fra ubehandlede (F), eller fra 2 timer (G) eller 4 timer (H) mitomycin C-behandlede kulturer.Positive resultater producere en dobbelt rød linje.

Figur 5:. Fotografi af en Coomassie-farvet SDS-PAGE BSA blev isoleret fra opløsningen ved hjælp af ekstraktion pipette og beskrevet protokoller. Banerne A og C er kontrolbaner på 250 ug / ml og 500 ug / mL hhv. Bane B og D viser udvindes BSA fra opløsninger indeholdende de samme koncentrationer som deres respektive kontroller.

Discussion

Værktøjet, kemier og protokollen beskrevet i denne rapport repræsenterer den første kendte eksempel på en el-fri, multi-makromolekyle ekstraktion, der kan anvendes i felten, point-of-care anvendelser. Begge makromolekyle typer kan anvendes til en række efterfølgende diagnostiske eller analytisk udstyr. For eksempel er de isolerede nukleinsyrer PCR kvalitet (fig. 2 og 3), medens proteinet komponent af prøven er immunoreaktive (figur 4). Udnyttelsen af ​​dette udsugningssystem i barske eller ressource begrænsede områder i verden kunne drastisk reducere sygdomsbyrden for de befolkninger, der lever der. Dette udsugningssystemet kan også hjælpe med sygdomsovervågning programmer i hele verden ved at give en robust og hurtig og omkostningseffektiv metode til at prøve behandling i barske eller fjerntliggende steder.

Et vigtigt aspekt ved ekstraktion fremgangsmåde beskrevet ovenfor er, atDet kan modificeres af brugeren. For eksempel i tilfælde, hvor prøven er større eller mindre end de oprindelige 500 μLs (trin 1.2) kan brugeren justere mængden af ​​reagenserne i overensstemmelse hermed. Dvs., det volumetriske forhold mellem reagenserne til prøvens størrelse bør forblive konstant, medens de absolutte mængder kan ændres. Desuden kan ændringer i antallet af passager over adsorbenten også gøres ved brugerens skøn. For eksempel, hvis en større prøvevolumen anvendes lede prøven gennem sorberende flere gange, end der er anført (trin 2.4 og 3.3) vil øge sandsynligheden for makromolekylet type (nucleinsyre eller protein) kontakt mellem sorbenten. Stigningen i passager bør øge fange effektiviteten indtil sorbent mætning er nået.

Vi har fundet, at udvinding værktøjet og tilhørende kemier har nogle begrænsninger, den vigtigste af dem er, at proteinekstraktion kemi er ineffektiv til udvinding af stærkt glykosyleretproteiner. I tilfælde af at den nedstrøms diagnostiske målretter et glycosyleret protein, kan dette system ikke er ideel til identifikation. Derudover er de øvre og nedre grænser for ekstraktions effektivitet for enten nukleinsyrer eller proteiner stadig bestemmes, og optimering er i gang for at maksimere genvinding effektivitetsgevinster. Videreudvikling af værktøjet vil overvinde disse eksisterende huller i vores viden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guanidine Thiocyanate	TEKnova, Inc.	G4000
ethanol	Pharmco-AAPER	11ACS200
2-propanol	Sigma-Aldrich	109827-1L
BSA	Sigma-Aldrich	A-4503