Summary
ツールと化学が順次電気を必要とせずにサンプルからのタンパク質に続いて核酸を分離するために記述されています。このツールは、分離化学を固相抽出の原則に基づいている間に転送ピペット内に保持されて吸着剤から構成されています。隔離された高分子は、免疫系とPCRベースのアッセイにより分析することができます。
Abstract
従来のような腸管出血性大腸菌 （EHEC）などの新興病原体、 ペスト菌、またはプリオンベースの疾患は、政府、産業、世界的な医療専門家のための重要な関心事である。たとえば、 赤痢菌と組み合わせるEHECsは、約325,000子供毎年の死に責任があると、米国で一般的な実験室ベースの識別が、1は使用できません発展途上国で特に普及している。低コストの開発と配布は、病原体や疾病マーカーの迅速な同定および/または診断のため、フィールドベースの、ポイントオブケアツールが劇的に病気の進行と患者の予後を変える可能性があります。我々は電気や関連する実験装置2せずに固相抽出（SPE）によってサンプルから核酸とタンパク質を分離するためのツールを開発しました。隔離された高分子はdiagnoに使用することができます前方にラボまたはフィールドベースのポイント·オブ·ケア·プラットフォームを使用して、いずれかのSIS。重要なのは、このメソッドは、ゲノムおよびプロテオーム解析の確証を通じて信頼を提供し、核酸および非分割試料からの蛋白質データの直接比較を提供します。
私たちのアイソレーションツールは、固相核酸の分離のための業界標準、シリカベースの粒子やフィルタ3への結合を介して、通常、カオトロピック塩溶液、グアニジンイソチオシアネートから核酸を分離するBOOM技術を利用しています。 CUBRC独自の固相抽出の化学は、核酸の分離4次の廃棄物やフロースルーから、このケースでは、カオトロピック塩溶液からタンパク質を精製するために使用されています。
包装することにより、小型で安価でシンプルなプラットフォームに化学反応を十分に特徴付けられ、我々は、varの下に行うことができ、核酸とタンパク質抽出のためのポータブルシステムを生成した条件のiety。単離された核酸は安定であり、タンパク質含有量がすぐに開かれた手や他の免疫ベースのアッセイで分析することができますが電源がPCR増幅のために使用可能な位置に移送することができます。フィールド内の疾患マーカーの迅速な同定が大幅に疾患の進行の早い段階で治療の適切なコースを向けることによって、患者の転帰を変更することができます。説明するツールと方法が実質的にすべての感染性病原体での使用に適していると同時に、それらの物流負担を軽減しながら、ユーザーに複数の高分子型解析の冗長性を提供します。
Protocol
1。サンプルの溶解
- サンプルが液体の形でなければなりません。サンプルが固体である場合、たとえば食品や便のために、サンプルは緩衝生理食塩水（PBS）などの水やリン酸塩として液体培地中に懸濁させなければなりません。
- 1.5 mlチューブに6Mグアニジンチオシアネート（pH6.5）を500μLの試料の500μLを混和します。
- 周囲の空気を追い出し、抽出ピペットのバルブを押し下げます。
- 電球が徐々に拡大することにより、吸着剤材料の上に、抽出ピペットに全体の1 mLのサンプルを引き出します。
- このような電球に吸着ビーズとサンプルドレインその抽出ツールを反転します。
- 抽出ピペットの外にサンプルを追放しないように注意して電球のサンプルとの吸着剤ビーズを挽く。
2。核酸の抽出（ 図1、パネルA）
- 抽出ピペット（下向き開く）反転し、元の1.5 mlチューブに試料を追放する。 <Liは、>抽出ピペットの首に吸着剤を保つように注意しながら、適度な速度で、吸着剤を通過する、抽出ピペットに全体の1 mLのサンプルを引き出します。
- 電球を押すことによって1.5 mLのチューブにサンプル全体を追放する。
- 5パスの合計吸着4回以上のサンプルを渡して、ステップ2.2と2.3を繰り返します。
- 吸着剤上の5番目のパスの後、タンパク質抽出緩衝液（15 mLコニカルチューブ）の4MLに全体の1 mLのサンプルを追放、チューブを閉じて、後で使用するために脇に置きます。
- 最後の一節に、元のチューブにエタノールを返す、吸着剤3倍以上の95％エタノール1mLを渡すことによって、単離された核酸を洗浄します。
- 1秒加え、95％エタノール洗浄を使用して2.6を繰り返します。
- 核酸/吸着剤床を乾燥させ抽出ピペットを通して周囲の空気を通過し、5分間バルブを押して離します。抽出ピペットuの先端からエタノールを拭くキムワイプを歌う。
- 吸着剤の5倍以上の10 mMトリス（pH6.8）を250μLを渡すことによって、核酸を回復します。トリス緩衝液、例えばPBSなどの他の適当な水溶液で置き換えることができます。得られた溶液を抽出した核酸を含んでいます。
3。タンパク質の抽出（図1、パネルB）
- 反転することにより、ステップ2.5からのサンプルとタンパク質抽出バッファーチューブをミックスして新しい抽出ピペットの吸着剤を介してこの5 mLの試料の約2〜3ミリリットルを渡します。
- 抽出ピペットの首に吸着剤を保つように注意して同じ15mlのコニカルチューブにサンプル全体を追放する。
- 吸着剤の15倍以上のサンプルを渡して、ステップ3.1および3.2を繰り返します。
- 吸着剤床の上に三回、その元のチューブに取り出すエタノールを95％エタノール1mLを渡すことによって、吸着剤と結合したタンパク質を洗浄します。
- 1秒加え、95％エタノール洗浄を使用して3.4を繰り返します。
- 蛋白質/吸着剤床を乾燥させ抽出ピペットを通して周囲の空気を通過し、5分間バルブを押して離します。キムワイプを用いて抽出ピペットの先端からエタノールを拭きます。
- 吸着剤の5倍以上のPBS 250μLを渡すことによって、タンパク質を回復します。 PBS緩衝液は、例えば、10mMトリス（pH6.8）を、任意の他の適当な水溶液で置き換えることができます。得られた溶液は、試料のタンパク質含有量を含んでいます。
図1。
図2。
図3。
図4。
図5。
Representative Results
核酸分離：単離された核酸は、PCR増幅とタンパク質の混入は無料です。
例1：回復した核酸は、PCRベースのアプリケーションでの使用に適している。たとえば、 図2は、腸管出血性大腸菌に関連付けられた志賀毒素遺伝子の増幅を示しています。 大腸菌 O157：抽出ピペットを用いて核酸/タンパク質抽出プロシージャからH7株EDL-933（ATCC＃35150）。志賀毒素遺伝子STX 1 STX 2は温帯ラムダのようなバクテリオファージ、これと他の腸管出血性大腸菌の欠陥バクテリオファージで発見されたP Rプロモーター5 6 7 8の制御下に大腸菌株。 E.のSOS応答の活性化大腸菌誘導および/ または毒素産生9ファージにつながる。我々は、Feng らによる多重PCR法の修正版を利用しました1。文化やスパイク下水サンプルの両方でSTX 1 STX 2遺伝子を識別するために1。レーンは、 図2のAとBは未処理の培養サンプル（レーンA）のPCR増幅および処理培養サンプル（レーンB）の結果を示しています。これらの結果は、処理または単離された核酸の忠実度の損失はありません実質的に同一の意味である。我々は次のスパイク生下水（レーンD）またはスパイク下水（レーンE＆F）から単離された核酸を増幅した。これらのデータは、単離された核酸は、スパイク下水試料からの非単離された核酸に対して大きな増幅をもたらしたことを示しています。そこで我々は自然に下水に見られるPCR阻害物質のいずれかが分離時に削除されたこと、または核酸の分離に集中していたと結論付けている。これら二つの仮説の組み合わせも可能です。
紫外分光法は、次の単離された核酸は比較的自由だったことを示すために使用されたOfの夾雑タンパク質。 図3は、2つの EのUVスペクトルを示しています。 大腸菌 O157：H7核酸抽出、標識された分離と分離bは、細菌培養の正規化されたスペクトルと比較して、事前に分離標識した。単離された核酸のUVスペクトルは260 nmと1.8 10に近づいて 280nmでの吸光度の計算された比を有する、純粋な核酸のスペクトルに似ています。これらのデータは記載された技術を用いて回収核酸分画にはほとんど夾雑タンパク質があることを示しています。
タンパク質のアイソレーション：核酸/タンパク質分離実験から回収したタンパク質は、免疫反応性と純粋な蛋白質に電気泳動的に同一である。
例2：単離されたタンパク質画分をRapidChek E.に適用された大腸菌 O157ラテラルフローアッセイストリップ（SDIX株式会社）。コントロールはE.を抱いて 、すべてのサンプルで陽性の識別を表示する大腸菌 STXの誘導（ 図4、レーンA、BおよびC、それぞれ）の有無にかかわらずO157、。 図4のデータは、E.を抱いて 、これらのサンプルで陽性結果を示す。抽出ピペットを用いて核酸や、タンパク質のために処理した大腸菌 O157。これらのデータは、各サンプルから単離されたタンパク質はこのように肯定的な反応を誘発する免疫反応性であることを示している。
PCR増幅は、（実施例1に記載のように）単離されたタンパク質画分は核酸の混入を欠いていたことを示すために、タンパク質サンプルを行った。これらの実験の結果は、ゲル電気泳動により、すべて陰性であった。そこで、サンプルのタンパク質含量は核酸を汚染から分離されたと結論付けている。これらの結果は、核酸とタンパク質含有量は別々の分画工程で分離されている核酸の分離ステップショーのために記載されていると全体での撮影です。
t "は>例3：単離されたタンパク質は電気泳動10に適している図5は、BSA（図5、レーン＆C）とBSAがロードされクマシー染色し、8％アクリルアミドゲル抽出ピペットを使用して、6Mグアニジンイソチオシアネートから単離され、関連付けられている示しています。プロトコル。単離されたタンパク質の電気泳動移動度は、対照試料と同一です。我々はこのように、抽出プロセスが単離されたタンパク質の共有結合構造を変更しないと結論付けている。
図1、パネルA：典型的な核酸抽出手順の描写サンプルがサンプルチューブ内の6Mグアニジンチオシアネートと混合して吸着剤を5回にわたって渡されます。最後に通過した後、試料をタンパク質抽出バッファーに追加されます。吸着剤と結合した核酸をエタノールで2回洗浄する。サンプルでは、その後空気dですリートと吸着剤から溶出した。
図1、パネルB：典型的なタンパク質抽出手順の描写ステップ1、 図1、第2の抽出ピペットの15倍の吸着剤を介して渡されたパネルからタンパク質の単離緩衝液と混合したサンプル。手順の残りの部分は、核酸抽出プロトコルのと同じです。
図2：エチジウムブロマイド染色したアガロースゲルのネガティブ画像の多重化志賀毒素1と2の遺伝子増幅実験を培養試料（レーンAおよびB）または大腸菌でスパイクした生下水試料を用いて行った。 大腸菌 O157：H7（レーンD、EおよびF）。サンプルは、直接PCR反応チューブに添加した（レーンD）またはサンプルは、分離プロセスへを使用して処理されたsと抽出した核酸は、PCR反応チューブ（サンプルB、EおよびF）に追加されました。 PCRプロトコルは、Feng ら 11で説明したものを修正したものです。私たちの変更は、他のすべてのプライマーペアをドロップアウト、STX 1（下部バンド）及びSTX 2（上部バンド）のプライマー対により増幅されたもののみ対象とした。レーンCは、バイオラッドから1KBラダーです。
図3：E.のUV分光法の結果大腸菌 O157：H7核酸が報告された抽出ピペットを用いて単離された単離された核酸を分離し、分離のbというラベルが付いています。サンプルのUVスペクトルは、前の核酸抽出にテストされています、事前に分離ラベルが付いています。スペクトルは日立U3010分光光度計および関連するソフトウェアパッケージを使用して得られた。
図4：RapidChekテストストリップのカラー写真を図2に使用されるサンプルのタンパク質含量は、抽出ピペットを用いて分離し、ラテラルフローアッセイにより免疫反応性について試験した。レーンACが未処理のコントロールであり、つまり、細胞培養は、核酸またはタンパク質を抽出せずに、テストストリップを追加しました。レーンであるE.陰性対照として大腸菌 BL21 DE3 pLysSを、レーンA、BおよびCのショーE.大腸菌 O157：H7（B）未処理であった、または4時間のマイトマイシンCで処理する（C）。 A〜HのレーンDは、ラテラルフローテストストリップに抽出したタンパク質を追加した結果を示しています。レーンDとEは大腸菌からのタンパク質抽出物を用いてプローブしたどちらかの（D）なしまたは負の対照としてマイトマイシンC処理（E）と大腸菌 BL21 DE3 pLysSを。 E.からタンパク質を抽出したときFHの結果を示すレーン大腸菌 O157：H7が使用されています。タンパク質は、（F）未処理、または2時間（G）または4時間（H）マイトマイシンC処理した培養物から抽出した。肯定的な結果は、二重赤線を生成します。
図5：クマシー染色したSDS-PAGEの写真 BSAは、抽出ピペットと説明したプロトコルを使用して溶液から単離した。レーンとCそれぞれ250μg/ mLで、500μg/ mLのコントロール·レーンである。レーンBとDは、それぞれのコントロールと同じ濃度を含む溶液から回収したBSAを描いています。
Discussion
このレポートに記載され、ツール、化学およびプロトコルは、フィールドベースの、ポイントオブケアのアプリケーションで利用することができる電気フリー、マルチ高分子抽出システムの最初の知られている例を表しています。両方の高分子型は、下流の診断や分析デバイスの数に適用することができます。サンプルのタンパク質成分は、（ 図4）免疫反応性でありながら、例えば、単離された核酸は、PCRの品質（ 図2および3）である。世界の緊縮やリソースの限られた地域では、この抽出システムの利用率が大幅にそこに住んでいる集団に疾患の負担を減らすことができます。この抽出システムは、禁欲的な、または遠隔地でのサンプル処理のための堅牢でありながら、迅速かつ費用対効果の高い方法を提供することによって、世界中の疾病のサーベイランスプログラムに役立つ可能性があります。
上記の抽出方法の1つの重要な側面は、ということですそれはユーザによって変更することができます。たとえば、サンプルのサイズは最初の500μLs（ステップ1.2）より大きいか小さい場合には、ユーザーがそれに応じて試薬の量を調整することができます。絶対的なボリュームを変更することができますが、つまり、サンプルサイズに試薬の体積比は一定のままにしてください。また、吸着剤上の通路の数の調整は、ユーザーの裁量で行うことができます。大規模なサンプル量が使用されている場合たとえば、記載されているよりも吸着剤回以上（ステップ2.4＆3.3）上のサンプルを渡すと、吸着剤に接触する高分子型（核酸またはタンパク質）の可能性を増加します。吸着飽和に達するまでの通路の増加は、捕獲効率を高める必要があります。
我々は、抽出ツールとそれに関連する化学物質は、タンパク質の抽出化学が高度にグリコシル化の回復のために非効率であることである最も重要なそのうちのいくつかの制限を持っていることを発見したタンパク質。下流の診断は、グリコシル化タンパク質を対象としているイベントでは、このシステムは、識別のための理想的ではありません。さらに、核酸またはタンパク質のいずれかの抽出効率の上限と下限はまだ決定され、最適化は回復効率を最大化するために進行中です。ツールの更なる発展は、これらの現在の知識のギャップを克服します。
Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
抽出ピペットの開発のための資金は、DRPに授与され、社内の研究開発の助成金によって部分的に提供されていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine Thiocyanate | TEKnova, Inc. | G4000 | |
| ethanol | Pharmco-AAPER | 11ACS200 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A-4503 |
References
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