Summary
Een instrument en chemicaliën beschreven sequentieel isoleren nucleïnezuren gevolgd door eiwitten van een monster zonder electriciteit. De tool bestaat uit een sorptiemiddel gehouden binnen een transferpipet, terwijl de isolatie chemie zijn gebaseerd op de vaste-fase-extractie principes. De geïsoleerde macromoleculen kan geanalyseerd worden door immuno-gebaseerde en PCR-gebaseerde assays.
Abstract
Traditionele en nieuwe ziekteverwekkers zoals enterohemorragische Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, of prion-ziekten te zijn van grote zorg voor overheden, industrie en medische professionals over de hele wereld. Bijvoorbeeld, EHECS, in combinatie met Shigella, zijn verantwoordelijk voor de dood van ongeveer 325.000 kinderen per jaar en zijn vooral in de ontwikkelingslanden, waar het laboratorium op basis van identificatie, gebruikelijk in de Verenigde Staten, is niet beschikbaar 1. De ontwikkeling en distributie van lage kosten, zou veld-based, point-of-care tools om te helpen bij de snelle identificatie en / of diagnose van pathogenen of ziekte markers drastisch veranderen progressie van de ziekte en de patiënt prognose. Wij hebben een tool ontwikkeld om nucleïnezuren en eiwitten uit een monster isoleren door vaste-fase-extractie (SPE) zonder elektriciteit of aanverwante laboratoriumapparatuur 2. De geïsoleerde macromoleculen kan worden gebruikt voor diagnosis hetzij in een voorwaartse lab of het gebruik van field-based point-of-care platformen. Belangrijk is dat deze methode voorziet in de directe vergelijking van nucleïnezuur en eiwit gegevens uit een niet-splitsing monster, met een vertrouwen door de bevestiging van genomics en proteomics analyse.
De isolatie gereedschap gebruikt de standaard voor vaste-fase geïsoleerd nucleïnezuur, de BOOM technologie, die nucleïnezuren een chaotropische zoutoplossing, gewoonlijk guanidine isothiocyanaat door binding aan silica gebaseerde deeltjes of filters 3 isoleert. Eigen vaste fase CUBRC de extractie chemie wordt gebruikt om eiwitten te zuiveren van chaotrope zoutoplossingen, in dit geval uit het afval of stroom-through na nucleïnezuursequentie isolatie 4.
Door verpakking chemie gekarakteriseerde in een kleine, goedkope en eenvoudige platform, hebben we een draagbaar gegenereerd voor nucleïnezuur en eiwit-extractie kan worden uitgevoerd onder variety voorwaarden. De geïsoleerde nucleïnezuren zijn stabiel en kunnen worden afgevoerd naar een positie waar vermogen voor PCR amplificatie terwijl het eiwitgehalte kan direct geanalyseerd door gehouden hand of andere immunologische gebaseerde assays. De snelle identificatie van ziekte markers in het veld kan de patiënt uitkomst significant te veranderen door de leiding van de juiste loop van de behandeling in een eerder stadium van de progressie van de ziekte. Het gereedschap en de beschreven methode zijn geschikt voor gebruik met vrijwel alle infectieuze agens en bieden de gebruiker de redundantie van multi-macromolecuul soort analyses en tegelijkertijd de vermindering van de logistieke last.
Protocol
1. Voorbeeld Lysis
- Monsters moet in vloeibare vorm. Als voorbeeld is vast, bijvoorbeeld voedsel of kruk, dient het monster gesuspendeerd in een vloeibaar medium zoals water of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Meng 500 pi van het monster met 500 pi van 6M guanidinethiocyanaat (pH 6,5) in 1,5 mL buis.
- Druk op de bol van een extractie pipet, het verdrijven van de omgevingslucht.
- Trek de gehele 1 ml monster in de winning pipet, over de sorptiemiddel, doordat de lamp langzaam uit te breiden.
- Keer de extractie tool dat het sorptiemiddel kralen en monster afvoer in de bol.
- Maal het sorbent kralen met het monster in de lamp zorg dat u het monster te verdrijven uit de extractie pipet.
2. Nucleic Acid Extractie (figuur 1, paneel A)
- Keer de winning pipet (opening naar beneden) en de uitzetting van het monster in de oorspronkelijke 1,5 mL buis. <li> Trek de gehele 1 ml monster in de winning pipet, die over de sorptiemiddel, met een gemiddelde snelheid, let daarbij goed op het sorptiemiddel te houden in de hals van de winning pipet.
- Verdrijf de gehele monster in de 1,5 ml buis door het indrukken van de lamp.
- Herhaal stap 2.2 en 2.3 het monster op het sorptiemiddel vier keer voor een totaal van 5 doorgangen.
- Na de vijfde pas over de sorptiemiddel, de gehele 1 ml monster te verdrijven in 4 ml van het eiwit extractiebuffer (in een 15 ml conische buis), sluit de buis, en zet ze opzij voor later gebruik.
- Was de geïsoleerde nucleïnezuren door het passeren van 1 ml ethanol 95% meer dan het sorptiemiddel drie keer, retourneren van de ethanol in de oorspronkelijke buis bij de laatste passage.
- Herhaal stap 2.6 met behulp van een tweede 1 ml, 95% ethanol wassen.
- Druk op de lamp voor 5 minuten, het passeren van de omgevingslucht in de winning pipet om de nucleïnezuren / sorptiebed drogen. Veeg resterende ethanol uit de punt van de winning pipet uzingen een Kimwipe.
- Terugwinnen nucleïnezuren passeren 250 ul 10 mM Tris (pH 6,8) op het absorptiemiddel vijf keer. De Tris buffer kan worden vervangen door andere geschikte waterige oplossing zoals PBS. De resulterende oplossing bevat de geëxtraheerde nucleïnezuren.
3. Protein Extractie (figuur 1, paneel B)
- Meng het monster en eiwit extractiebuffer buis vanaf stap 2.5 door omkeren en gaan ongeveer twee tot drie milliliter van deze 5 ml steekproef over het sorptiemiddel van een nieuwe extractie pipet.
- Verdrijf het gehele monster in dezelfde 15 ml conische buis let daarbij goed op het sorptiemiddel te houden in de hals van de winning pipet.
- Herhaal stap 3.1 en 3.2, het monster op het sorptiemiddel 15 keer.
- Was de sorptiemiddel en de gebonden eiwit door het passeren van 1 ml ethanol 95% meer dan het sorptiebed drie keer, het uitwerpen van de ethanol in de originele buis.
- Herhaal stap 3.4 met behulp van een tweede 1 ml, 95% ethanol wassen.
- Druk op de lamp voor 5 minuten, het passeren van de omgevingslucht in de winning pipet aan het eiwit / sorptiebed drogen. Veeg resterende ethanol uit de punt van de extractie met behulp van een pipet kimwipe.
- Recover het eiwit door het passeren van 250 ul van PBS over de absorptiemiddel vijf keer. De PBS buffer kan worden vervangen door elke andere geschikte waterige oplossing zoals 10 mM Tris (pH 6,8). De resulterende oplossing bevat het eiwitgehalte van het monster.
Figuur 1.
Figuur 2.
Figuur 3.
Figuur 4.
Figuur 5.
Representative Results
Nucleic Acid Isolatie: Geïsoleerde nucleïnezuren zijn PCR amplificeerbaar en vrij van eiwit besmetting.
Voorbeeld 1: Het teruggewonnen nucleïnezuren geschikt voor PCR-toepassingen. In figuur 2 toont de amplificatie van Shigatoxine genen geassocieerd met enterohemorragische E. coli O157: H7-stam EDL-933 (ATCC # 35150) van een nucleïnezuur / eiwitextractie procedure met behulp van de extractie pipet. De Shiga toxine genen stx 1 en stx 2 worden gevonden op gematigde lambda-achtige bacteriofaag en defecte bacteriofaag in deze en andere enterohemorragische E. coli stammen onder besturing van de P R promoter 5 6 7 8. De activering van SOS de reactie in E. coli leidt tot profaag inductie en / of toxine productie 9. We hebben gebruik gemaakt van een gewijzigde versie van de gemultiplexte PCR door Feng et al. 1.1 op de STX 1 en stx 2 genen bij zowel cultuur als spiked riolering monsters te identificeren. Lanen A en B in figuur 2 tonen de resultaten van een PCR-amplificatie van een onbewerkte cultuur monster (laan A) en verwerkt cultuur monster (laan B). Deze resultaten zijn vrijwel identiek betekent dat er geen verlies van trouw in de verwerkte of geïsoleerde nucleïnezuren. We volgende versterkt spiked ongezuiverd rioolwater (laan D) of geïsoleerde nucleïnezuren uit spiked rioolwater (lanen E & F). Deze gegevens geven aan dat de geïsoleerde nucleïnezuren leidt tot een grotere versterking versus niet-geïsoleerde nucleïnezuren van verrijkte monsters afvalwater. We concluderen daarom dat beide PCR-inhibitoren die van nature in riolering werden verwijderd wanneer de cellen, of dat de nucleïnezuren werden geconcentreerd op isolatie. Een combinatie van deze twee hypothesen is ook mogelijk.
Ultraviolet spectroscopie werd vervolgens aangetoond dat het gebruik van de geïsoleerde nucleïnezuren relatief vrij of contaminerende eiwitten. Figuur 3 toont de UV-spectra van twee E. coli O157: H7 nucleïnezuur extracties gelabeld isolatie a en b isolatie, in vergelijking met de genormaliseerde spectrum van de bacteriecultuur gelabeld pre-isolatie. De UV-spectra van de geïsoleerde nucleïnezuren lijkt de spectra van zuivere nucleïnezuren, met een berekend verhouding van absorptie tussen 260 nm en 280 nm 1,8 naderen 10. Deze gegevens tonen dat er weinig verontreinigende eiwit in het nucleïnezuur fractie teruggewonnen met de beschreven techniek.
Eiwit Isolatie: Hersteld eiwit uit de nucleïnezuur / eiwitisolatie experiment is immunoreactieve en elektroforetisch identiek aan pure eiwit.
Voorbeeld 2: Het geïsoleerde eiwitfractie werd toegepast om de RapidChek E. coli O157 laterale flow test strips (SDIX, Inc.) Controls tonen een positieve identificatie in alle monsters herbergen E. coli O157, met of zonder STX inductie (Figuur 4, banen B en C respectievelijk). De gegevens in fig. 4 tonen ook positieve resultaten die monsters herbergen E. coli O157 die werden verwerkt voor nucleïnezuren en eiwitten met behulp van de winning pipet. Deze gegevens tonen aan dat de geïsoleerde eiwit uit elk monster immunoreactieve is dus waarvan een positieve reactie.
PCR amplificatie (zoals beschreven in voorbeeld 1) werd uitgevoerd op het eiwit monsters te zien dat de geïsoleerde eiwitfractie mist contaminerende nucleïnezuren. De resultaten van deze experimenten waren negatief door gelelektroforese. Zo kunnen we concluderen dat het eiwitgehalte van het monster werd gescheiden van contaminerende nucleïnezuren. Deze resultaten, die in zijn geheel met die beschreven voor de nucleïnezuur isolatie stap blijkt dat de nucleïnezuren en eiwitten geïsoleerd in afzonderlijke fractionering stappen.
t "> Voorbeeld 3. De geïsoleerde proteïne is geschikt voor elektroforese 10 Figuur 5 toont een Coomassie gekleurd 8% acrylamide gel geladen met BSA (figuur 5 lanen A & C) en BSA geïsoleerd uit 6M guanidine isothiocyanaat met de pipet en bijbehorende protocol. De elektroforetische mobiliteit van de geïsoleerde eiwitten is identiek aan die van de controle monsters. We concluderen dat het extractieproces niet de covalente structuur van de geïsoleerde eiwitten te veranderen.
Figuur 1, Panel A: Afbeelding van een typische nucleïnezuur extractieprocedure Het monster wordt gemengd met 6M guanidine thiocyanaat in de steekproef buis en hij toog over het sorptiemiddel vijf keer.. Na de laatste passage wordt het monster toegevoegd om het proteïne extractiebuffer. De sorbent gebonden en nucleïnezuren worden tweemaal gewassen met ethanol. Het monster wordt vervolgens lucht dRied en geëlueerd van het sorbens.
Figuur 1, Paneel B: Afbeelding van een typische eiwitextractie procedure Het monster, gemengd met eiwit isolatie buffer vanaf stap 1, figuur 1, paneel A wordt over de Sorbens van een tweede extractie pipet 15 keer.. De rest van de procedure is identiek aan die van het nucleïnezuur extractieprotocol.
Figuur 2. Negatief beeld van een ethidium bromide gekleurd agarosegel een gemultiplexte Shigatoxine 1 en 2 genamplificatie experiment werd uitgevoerd met kweken (lanen A en B) of rioolwater monsters verrijkt met E. coli O157: H7 (lanen D, E en F). De monsters werden direct toegevoegd aan een PCR-reactie buis (lanen A en D) of monsters werden behandeld met de isolatie process en geëxtraheerd nucleïnezuren toegevoegd aan de PCR-reactie buis (monsters B, E en F). De PCR-protocol is een modificatie van de beschreven door Feng et al. 11. Onze modificatie alleen gericht die versterkt door de STX 1 (onderste band) en STX 2 (bovenste band) primerparen, vallen alle andere primer paren. Lane C is de 1kb ladder van BioRad.
Figuur 3: UV-spectroscopie resultaten E. coli O157: H7 nucleïnezuren geïsoleerd door middel van de gerapporteerde extractie pipet De geïsoleerde nucleïnezuren zijn gelabeld isolatie een en isolatie. b. De UV-spectrum van het monster werd getest voordat nucleïnezuur extractie en vermeld pre-isolatie. De spectra werden verkregen met een Hitachi U3010 spectrofotometer en bijbehorende pakket.
Figuur 4. Kleurenfoto van RapidChek teststroken het eiwitgehalte van de monsters in figuur 2 werd geïsoleerd met behulp van de pipet en getest voor immuno-reactiviteit laterale stroom assay. Lanes AC niet verwerkt zijn controles, dat wil zeggen, celcultuur werd op de teststrip toegevoegd zonder nucleïnezuur of eiwit-extractie. Lane A E. coli BL21 DE3 pLysS als een negatieve controle, Lanes B en C tonen E. coli O157: H7 die niet behandeld (B), of behandeld met mitomycine C gedurende 4 uur (C). Lanen D door H tonen de resultaten van het toevoegen van de geëxtraheerde eiwit aan het laterale flow teststrips. Lanes D en E werden getest met behulp van eiwit extract van E. coli BL21 DE3 pLysS of zonder (D) of met mitomycine C behandeling (E) als negatieve controles. Lanes FH tonen de resultaten bij het gewonnen eiwit van E. coli O157: H7 werd gebruikt. Eiwit werd geëxtraheerd uit onbehandeld (F), of van 2 uur (G) of 4 uur (H) Mitomycine C behandeld culturen.Positieve resultaten van een dubbele rode lijn.
Figuur 5. Foto van een Coomassie gekleurde SDS-PAGE BSA werd geïsoleerd uit de oplossing met de pipet en beschreven protocollen. Lanen A en C rijstroken van 250 pg / ml en 500 pg / ml. Lanen B en D tonen teruggewonnen BSA uit oplossingen die dezelfde concentraties als hun controles.
Discussion
De tool, chemie en protocol in dit rapport beschreven staan voor de eerste bekende voorbeeld van een elektriciteit-free, multi-macromolecuul extractie systeem dat gebruikt kan worden in het veld op basis van, point-of-care toepassingen. Beide macromolecuul types kan worden toegepast op een aantal verdere diagnostische of analyseapparatuur. Bijvoorbeeld, de geïsoleerde nucleïnezuren van PCR kwaliteit (figuur 2 en 3), terwijl de eiwitbestanddeel van het monster immunoreactieve (figuur 4). Het gebruik van deze extractie systeem in sobere of bron beperkte gebieden van de wereld zou kunnen drastische vermindering van de ziektelast in de bevolking die er wonen. Deze extractie systeem zou ook kunnen helpen bij de ziekte van bewakingsprogramma's over de hele wereld door middel van een robuuste maar snelle en kosteneffectieve methode voor het monster verwerking in sobere of externe locaties.
Een belangrijk aspect van de extractie methode bovengenoemde datkan worden gewijzigd door de gebruiker. Bijvoorbeeld, wanneer steekproef groter of kleiner dan de initiële 500 μLs (stap 1.2), kan de gebruiker instellen van de hoeveelheden van de reagentia daarvan. Dat wil zeggen, de volumetrische verhouding van de reagentia aan de steekproefomvang moet constant blijven, terwijl het volume in absolute zin kan worden gewijzigd. Ook kan aanpassing van het aantal passages over het sorptiemiddel worden gemaakt naar keuze van de gebruiker. Als bijvoorbeeld een groter monstervolume wordt gebruikt, het monster op het sorptiemiddel vaker dan genoemde (stap 2.4 en 3.3) zal de waarschijnlijkheid van het macromolecuul type (nucleïnezuur of een eiwit) het in aanraking sorptiemiddel. De stijging van de passages moeten verhogen efficiëntie vast te leggen totdat sorbent verzadiging is bereikt.
We hebben ontdekt dat de extractie tool en de bijbehorende chemie een aantal beperkingen, de belangrijkste daarvan is dat het eiwit-extractie chemie is inefficiënt voor het herstel van zeer geglycosyleerd hebbeneiwitten. In het geval dat de verdere diagnostische een geglycosyleerd eiwit gericht kan dit stelsel niet geschikt voor identificatie. Bovendien worden de bovenste en onderste grens van extractie efficiënties voor een nucleïnezuren of eiwitten nog bepaald en optimalisatie gang om herstel te maximaliseren. Verdere ontwikkeling van het instrument zal het overwinnen van deze huidige kennis hiaten.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De financiering voor de ontwikkeling van de winning pipet werd verstrekt in het kader van een intern onderzoek en ontwikkeling subsidie voor DRP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine Thiocyanate | TEKnova, Inc. | G4000 | |
| ethanol | Pharmco-AAPER | 11ACS200 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A-4503 |
References
- Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005. Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).
- Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. Method and Device for Isolating a Protein Sample. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).
- O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea. Science. 226, 694-696 (1984).
- Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain. Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).
- Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages. DNA Research. 6, 141-143 (1999).
- Ptashne, M. A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , Third Edition ed, Cold Spring Harbor Press. (2004).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
- Feng, P., Monday, S. R. Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes. Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).
