Summary
कार्डिएक नाभिक घनत्व अवसादन के माध्यम से अलग कर रहे हैं और pericentriolar 1 सामग्री (PCM-1) की पहचान करने और प्रवाह cytometry से cardiomyocyte नाभिक तरह के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunolabeled.
Abstract
Cardiomyocyte नाभिक की पहचान ऊतक वर्गों में चुनौती रहा है के रूप में सबसे रणनीतियों cytoplasmic प्रोटीन मार्कर एक पर ही निर्भर हैं. प्रसार और apoptosis जैसे हृदय myocytes में दुर्लभ घटनाओं हृदय myocyte नाभिक का एक सटीक पहचान homeostasis में और रोग 2 परिस्थितियों में सेलुलर नवीकरण का विश्लेषण करने की आवश्यकता है. यहाँ, हम पोस्टमार्टम ऊतक से घनत्व और pericentriolar 1 सामग्री (PCM-1) और बाद में प्रवाह cytometry छँटाई के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ अवसादन immunolabeling द्वारा cardiomyocyte नाभिक अलग तरीका प्रदान करते हैं. इस रणनीति के एक उच्च throughput विश्लेषण और ताजा ऊतक और जमे हुए अभिलेखीय सामग्री पर समान रूप से अच्छी तरह से काम करने के लाभ के साथ अलगाव की अनुमति देता है. यह पहले से ही biobanks में एकत्र सामग्री का अध्ययन करने के लिए यह संभव बनाता है. इस तकनीक को लागू प्रजातियों में से एक विस्तृत रेंज में परीक्षण और कार्बन 14-3 डेटिंग, सेल cy जैसे कई बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैcle 4 विश्लेषण, thymidine analogues के दृश्य (जैसे BrdU और IDU) 4, transcriptome और epigenetic विश्लेषण.
Protocol
1. कार्डिएक नाभिक का अलगाव
- कोट 1% कोटिंग / BSA पीबीएस समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ ultracentrifuge ट्यूब (के Beckman अपकेंद्रित्र ट्यूबें 363,664). ट्यूबों कैप और उन्हें एक ट्यूब अंग को घुमानेवाली पेशी में 30 मिनट के लिए बारी बारी से. (जैसे मानव) कोटिंग समाधान निकालें और अपकेंद्रित्र ट्यूबों हवा शुष्क (माउस दिल के प्रति एक ट्यूब एक माउस दिल, बारी - बारी से करने के लिए 5 माउस दिल या हृदय के ऊतकों की 1 ग्राम की विभिन्न प्रजातियों में से विश्लेषण के लिए आवश्यक है संसाधित किया जा एक ट्यूब में).
- सभी निम्नलिखित कदम बर्फ पर किया जाना चाहिए. ताजा या एक स्केलपेल के साथ तस्वीर जमी माउस दिल के बाएं वेंट्रिकल से काटना. ध्यान दें, इस प्रोटोकॉल माउस दिल के लिए अनुकूलित है, लेकिन यह भी चूहे या मानव हृदय के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, हृदय के ऊतकों की 1 ग्राम की विभिन्न प्रजातियों से उपयोग.
- एक स्केलपेल के साथ छोटे cubicles में नमूना छाँटो.
- एक 50 मिलीलीटर फाल्कन lysis बफर के 15 मिलीलीटर से भरा ट्यूब में ऊतक टुकड़े हस्तांतरण.
- Homogenizeटी 25 10 सेकंड के लिए 24,000 rpm पर अल्ट्रा Turrax जांच homogenizer (IKA) के साथ हृदय के ऊतकों.
- Lysis बफर के बराबर 30 मिलीलीटर मात्रा के साथ homogenate पतला.
- एक गिलास douncer के (40 मिलीग्राम) का प्रयोग करने के लिए आगे ऊतक और मुक्त नाभिक homogenize. एक बड़ी निकासी मूसल के साथ आठ स्ट्रोक प्रदर्शन करते हैं.
- दर्रा कच्चे नाभिक एक 100 माइक्रोन और 70 माइक्रोन नायलॉन जाल सेल (बी.डी. बायोसाइंसेज) झरनी, लगातार के माध्यम से अलग.
- नीचे स्पिन कच्चे नाभिक 10 मिनट के लिए 700 XG पर एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस) में अलग.
- सतह पर तैरनेवाला सावधानी से और inverting ट्यूब द्वारा निकालें कागज तौलिया के साथ ट्यूब के अंदर पोंछे. के नाभिक गोली परेशान नहीं सावधान रहो.
- कच्चे नाभिक भंग समाधान pipetting कई बार ऊपर और नीचे sucrose के बफर के 5ml में अलग. भंग गोली sucrose के बफर के आगे 25 मिलीलीटर जोड़ें.
- लेपित ultracentrifuge ट्यूब (1.1 कदम देखें) हौसले तैयार sucrose के बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें. </ Li>
- ध्यान से resuspended नाभिक 1.9 कदम से sucrose के बफर में भंग गोली के साथ sucrose के बफर का जोड़ा 10 मिलीलीटर उपरिशायी.
- शेष अपकेंद्रित्र ट्यूबों JS13.1 मुक्त झूल रोटर में उन्हें रखने से पहले का रोटर और एक अपकेंद्रित्र उच्च गति (के Beckman अवंती एस -25) में जगह है.
- 13,000 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए नाभिक नमूना स्पिन.
- जब स्पिन पूरा कर लिया है, ट्यूब ध्यान से रोटर से और दूर inverting के ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला त्यागने और कागज तौलिया के साथ ट्यूबों के अंदर से शेष मलबे पोंछते.
- 1ml नाभिक भंडारण बफर (NSB प्लस बफर) के नाभिक गोली भंग. नोट: NSB प्लस एक डीएनए स्थिरता प्राप्त करने के रूप में 1.5 मिमी spermine शामिल है.
- 2.1 कदम के साथ आगे बढ़ना, cardiomyocyte नाभिक की Immunostaining.
2. फ्लो लिए Immunostaining है
- नकारात्मक नियंत्रण Immunostaining के लिए तैयार करते हैं. नाभिक नमूने के 20 μl बाहर के एक नि: शेष भाजक और ले लोडीडी - NSB अधिक बफर की 980 μl.
- 1:500 के एक कमजोर पड़ने में immunolabel cardiomyocyte नाभिक नाभिक नमूना विरोधी pericentriolar सामग्री 1 प्रतिरक्षी (खरगोश विरोधी पीसीएम-1, एटलस एंटीबॉडी) जोड़ें. विरोधी PCM-1 प्रतिरक्षी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ही कमजोर पड़ने, 2.1 चरण में तैयार के निर्धारण प्रतिरक्षी में जोड़ें.
- 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में नकारात्मक नियंत्रण और नमूना ट्यूब सेते हैं.
- नकारात्मक नियंत्रण और नमूना NSB प्लस बफर (नीचे 10 मिनट के लिए 700 XG पर प्रशीतित अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस) में ट्यूबों स्पिन सतह पर तैरनेवाला त्यागें और नाभिक NSB प्लस बफर के 1 मिलीग्राम में गोली भंग.) के साथ कम से कम एक बार धो लें.
- विरोधी खरगोश फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी (FITC या APC) के नकारात्मक और 1:1000 की एक कमजोर पड़ने में नमूना ट्यूब नियंत्रण जोड़ें.
- डिग्री सेल्सियस 4 में 1 घंटे के लिए नकारात्मक नियंत्रण और नमूना ट्यूब सेते हैं.
- नकारात्मक नियंत्रण और नमूना NSB प्लस बफर (10 मिनट के लिए नीचे एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस) में ट्यूबों 700 XG पर स्पिन के साथ कम से कम एक बार धो. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और NSB प्लस बफर 1 मिलीलीटर में नाभिक गोली भंग).
- प्रवाह cytometric विश्लेषण और छँटाई के साथ आगे बढ़ें.
3. फ्लो
- 1% समाधान / BSA पीबीएस है इससे पहले कि आप प्रवाह छँटाई 1.1 चरण में वर्णित के रूप में cytometry के शुरू के साथ कोट नाभिक संग्रह ट्यूब (फाल्कन 15 मिलीलीटर).
- नमूना और एक 30 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से नकारात्मक नियंत्रण फ़िल्टर और पहले प्रवाह cytometer नकारात्मक नियंत्रण लोड (बी.डी. बाढ़). पहली और दूसरी आगे तितर बितर (FSC), आगे तितर बितर पल्स चौड़ाई (एफएस पल्स चौड़ाई) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) (छवि 2a और ख) के आधार पर नाभिक और singlets (एकल नाभिक), परिभाषित फाटक को परिभाषित करें. नमूना करने के लिए एक दाग डीएनए DRAQ5 (1:500) को जोड़ने के नाभिक जनसंख्या शुरू की पहचान करने में मदद कर सकते हैं.
- लोड immunolabeled नमूना और तीसरे गेट को परिभाषित करने के लिए गैर cardiomyocyte नाभिक (PCM-1-नकारात्मक) से cardiomyocyte (पीसीएम-1-positve) के नाभिक को अलग. छँटाई प्रारंभ करें(छवि 2c और घ).
वैकल्पिक: आदेश में परमाणु डीएनए सामग्री (ploidy) के विश्लेषण और कोशिका चक्र विश्लेषण प्रदर्शन एक उचित डीएनए नाभिक (जैसे 33,342 Hoechst या DRAQ5) (छवि 2e) दाग जोड़ें.
- प्रवाह cytometry छँटाई के बाद, बर्फ पर नाभिक को जगह और छँटाई शुद्धता (से छवि 3a और ख) निर्धारित करने के लिए फिर से विश्लेषण.
- नीचे 15 मिनट के लिए प्रशीतित अपकेंद्रित्र में 1500 XG संग्रह ट्यूबों में सॉर्ट नाभिक स्पिन.
- एक बहाव आवेदन के साथ संगत बफर में नाभिक गोली भंग.
4. प्रतिनिधि परिणाम
नाभिक आकारिकी और अखंडता डीएनए दाग द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है और माइक्रोस्कोपी छवि (1) द्वारा कल्पना. सफल पीसीएम 1 लेबलिंग epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा और प्रवाह cytometry (1 छवि और छवि 2c. और घ) के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. PCM-1-की स्थितिकिया है और नकारात्मक आबादी अच्छी तरह से एक दूसरे से अलग किया जाना चाहिए (छवि 2c और घ). Murine बाएं वेंट्रिकल में सभी नाभिक के बारे में 30% cardiomyocyte नाभिक (छवि 2d). पवित्रता छंटनी फिर से हल नाभिक (छवि 3a और ख) का विश्लेषण करके मूल्यांकन किया जा सकता है. दोनों नाभिक आबादी एक छँटाई 95% से अधिक शुद्धता होना चाहिए.
आकृति 1. पीसीएम-1 cardiomyocyte नाभिक की पहचान कार्डिएक नाभिक (एक) से पीसीएम 1 (ख) और (ग) Nkx2.5 एक वयस्क माउस दिल में एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं. (घ) पीसीएम-1-लेबल नाभिक से cardiomyocyte cytoplasm (मायोसिन भारी श्रृंखला (MHC)) से घिरे रहे हैं और प्रतिलेखन Nkx2.5 कारक व्यक्त करते हैं, पीसीएम 1 धुंधला हो जाना (पैमाने सलाखों 20 माइक्रोन और 10 से cardiomyocyte नाभिक की सटीक पहचान का दस्तावेजीकरण माइक्रोन (घ, इनसेट)). (ङ) कार्डिएक नाभिक डीएनए के साथ कल्पना आइसोलेट्स DRAQ5 दाग. Cardiomyoc (च और छ)YTE नाभिक हैं पीसीएम 1 (पैमाने बार 10 माइक्रोन) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे हैं. ध्यान दें, ऊतक अनुभाग में myocyte नाभिक में और अलग नाभिक (तीर) में पीसीएम 1 epinuclear धुंधला पैटर्न.
चित्रा 2. Cardiomyocyte नाभिक के प्रवाह cytometric छँटाई (क) कार्डिएक नाभिक आगे तितर बितर (FSC) और बिखराव की ओर (एसएससी) द्वारा की पहचान कर रहे हैं. (ख) एक दूसरे गेट FSC और एफएस पल्स चौड़ाई 5 द्वारा एक नाभिक को पहचानती है. (ग, घ) प्रतिदीप्त gating के हृदय के ऊतकों से cardiomyocyte नाभिक की जुदाई (PCM-1-सकारात्मक) और गैर cardiomyocyte नाभिक (PCM-1-नकारात्मक) की अनुमति देता है. (ङ) माउस cardiomyocyte ज्यादातर (> 80%) (2n) द्विगुणित कर रहे हैं, केवल एक छोटे सबसेट में tetraploid है (4N) 6. नोट मानव cardiomyocytes polyploidy नाभिक के एक उच्च आवृत्ति (> 2n) 7,8 के होते हैं.
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Discussion
Cardiomyocyte नाभिक के सटीक पहचान 2,3 मायोकार्डियम में पुनर्योजी प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है. परम्परागत तकनीकों ताजा ऊतक से cardiomyocytes को अलग करने के लिए मुख्य रूप से बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के enzymatic पाचन और कम गति centrifugation द्वारा बीचवाला कोशिकाओं से बाद शुद्धि पर आधारित हैं. भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) से रह cardiomyocytes के आगे शोधन से 9 SIRPA या mitochondrial 10 रंजक के रूप में सतह मार्कर के साथ immunolabeling द्वारा निष्पादित किया जा सकता है, निश्चित cardiomyocytes मायोसिन भारी श्रृंखला (MHC) या इस तरह के रूप में परमाणु प्रोटीन के रूप में cytoplasmic मार्करों से पहचाना जा सकता है GATA4 या Nkx2.5. हालांकि, Nkx2.5 और GATA4 की अभिव्यक्ति परिपक्व cardiomyocytes के लिए ही सीमित नहीं है, लेकिन विकास के दौरान और हृदय 11,12 रोधगलन के बाद भी पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में पाया जा सकता है. Cardiomyocytes की पहचान के लिए आनुवंशिक रणनीति सर्वोच्च विशिष्टता, लेकिन ग दिखाannot बड़े पशु मॉडल या एक मनुष्य में लागू किया जाएगा. मौजूदा रणनीतियों की सीमाओं विवादास्पद निष्कर्ष जैसे प्रसार apoptosis के और 1,13 chimerism के दुर्लभ घटनाओं की मात्रा का ठहराव पर भरोसा करने के लिए नेतृत्व किया है. इस प्रकार, वहाँ के लिए एक सटीक रणनीति की पहचान करने और परिपक्व विभेदित cardiomyocyte नाभिक शुद्ध स्थापित करने की आवश्यकता है.
यहाँ, हम एक शोधन pericentriolar सामग्री 1 (पीसीएम-1) पर आधारित तकनीक का वर्णन. इससे पहले, हम दिखा रहा है कि तीन स्वतंत्र परमाणु मार्करों, पीसीएम-1, हृदय troponin टी और मैं, एक ही cardiomyocyte आबादी की पहचान हमारे नाभिक अलगाव की वैधता को मजबूत 2,3 शुद्ध जनसंख्या cardiomyocyte विशिष्ट जीन उत्पादों की एक उच्च संवर्धन से पता चला है. ऐसे हृदय troponins, मायोसिन भारी श्रृंखला प्रोटीन और प्रतिलेखन कारक Nkx2.5 और 2,3 GATA4 के रूप में.
मौजूदा प्रोटोकॉल, पीसीएम-1 पर आधारित है, सफलतापूर्वक किया गया है च लागूया मानव और माउस cardiomyocyte 2,4 कारोबार cardiomyocyte transcriptional 2 प्रोफ़ाइल के विश्लेषण के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह के विश्लेषण. हम आशा करते हैं कि प्रस्तुत रणनीति भी अन्य प्रजातियों से cardiomyocytes के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. पीसीएम-1, एक केंद्रपिंड प्रोटीन, परमाणु झिल्ली जहां इसे जमा करने के लिए फिर से localizes और विभेदित 2,14 (1 छवि) myocytes में केवल एक अघुलनशील मैट्रिक्स रूपों. प्रवाह cytometry कोशिकाओं, जो apoptosis और सेल चक्र 15 फिर से प्रवेश के रूप में cardiomyocytes में दुर्लभ घटनाओं यों के लिए आवश्यक है की एक उच्च संख्या के तेजी से निष्पक्ष विश्लेषण की अनुमति देता है. इसके अलावा, nucleotide analogues (जैसे BrdU) के आधारित प्रसार assays आसानी से हो सकता है हमारे प्रस्तुत 4 तकनीक का उपयोग कर लागू कर सकते हैं. हमारी तकनीक के लाभ है कि एकल cardiomyocyte नाभिक (परमाणु ploidy) के डीएनए सामग्री multinuclear 16,17 cardiomyocytes, जो महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है में विश्लेषण किया जा सकता हैcardiomyocyte दोहराव और 6-8 polyploidisation के बीच भेदभाव है. हालांकि, हमारी रणनीति की प्रकृति के कारण, cardiomyocyte multinucleation की एक लक्षण वर्णन संभव नहीं है.
प्रस्तुत विधि अनुप्रयोगों के आगे chromatin की epigenetic परिवर्तन, nucleoproteins,, protein-DNA/RNA बातचीत और परमाणु transcriptome 18,19 पर ध्यान केंद्रित अध्ययन कर रहे हैं.
ऊतक फ्रीज - विकल्प में नाभिक की स्थिरता की वजह से, प्रस्तुत नाभिक अलगाव रणनीति भी जमे हुए ऊतकों को लागू किया जा सकता है, यह biobanks से संग्रहीत सामग्री का उपयोग करने के लिए संभव बना रही है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम मार्सेलो टोरो प्रवाह cytometry के साथ सहायता के लिए स्वीकार करना है. इस अध्ययन स्वीडिश दिल और फेफड़े फाउंडेशन, यूरोपीय संघ आयोग के FP7 "CardioCell", स्वीडिश अनुसंधान परिषद, वायु सेना अकादमी बीमा और ALF द्वारा समर्थित किया गया था. ओ ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Lysis Buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Sucrose buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 2.1 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.44 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM spermine | |||
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam | ||
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences | ||
| Glass douncer (40 ml) and pestle "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany | ||
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR | ||
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter | ||
| Influx cytometer | Beckman Coulter | ||
| Tube Rotator | VWR |
References
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