Summary
Nuclei cardiaca sono isolati tramite sedimentazione densità e immunolabeled con anticorpi contro materiale pericentriolar 1 (PCM-1) per identificare e ordinare nuclei cardiomiociti mediante citometria a flusso.
Abstract
Identificazione dei nuclei cardiomiociti è stato impegnativo in sezioni di tessuto, come la maggior parte delle strategie di contare solo su proteine marker citoplasmatici 1. Eventi rari in miociti cardiaci quali la proliferazione e l'apoptosi richiedono una identificazione accurata dei miociti cardiaci nuclei di analizzare il rinnovamento cellulare in omeostasi e in condizioni patologiche 2. Qui, forniamo un metodo per isolare nuclei cardiomyocyte dal tessuto post mortem di sedimentazione densità e immunomarcatura con anticorpi contro materiale pericentriolar 1 (PCM-1) e la successiva selezione citometria a flusso. Questa strategia permette una analisi un elevato throughput e l'isolamento con il vantaggio di lavorare altrettanto bene su tessuti freschi e congelati materiale d'archivio. Ciò rende possibile studiare materiale già raccolto in biobanche. Questa tecnica è applicabile e testato in una vasta gamma di specie e adatto a molteplici applicazioni a valle, come il carbonio-14 datazione 3, cell-cyCLE analisi 4, la visualizzazione di analoghi della timidina (ad esempio BrdU e IDU) 4, l'analisi del trascrittoma ed epigenetici.
Protocol
1. Isolamento dei Nuclei Cardiac
- Coat tubi ultracentrifuga (Tubi centrifuga Beckman # 363664) con 10 ml di 1% BSA / PBS soluzione di rivestimento. Coprire le provette e farli ruotare per 30 minuti in un rotatore tubo. Rimuovere la soluzione di rivestimento e lasciare la centrifuga tubi aria secca (un tubo per il cuore di topo è richiesto per l'analisi di cuore di topo singoli, alternativamente fino a 5 cuore di topo o 1 g di tessuto cardiaco da una specie diversa (ad esempio umano) può essere elaborato in un tubo).
- Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti sul ghiaccio. Sezionare il ventricolo sinistro del mouse dal cuore fresco o snap-frozen con un bisturi. Attenzione, questo protocollo è ottimizzato per il cuore del mouse, ma può anche essere adattato per ratto o cuore umano. In alternativa, utilizzare fino a 1 g di tessuto cardiaco da una specie diversa.
- Tagliare il campione in cubicoli di piccole dimensioni con un bisturi.
- Trasferire i pezzi di tessuto in un tubo Falcon da 50 ml riempito con 15 ml di tampone di lisi.
- Omogeneizzare latessuto cardiaco con un T-25 Ultra-Turrax sonda omogeneizzatore (IKA) a 24.000 rpm per 10 sec.
- Diluire l'omogeneizzato con un volume uguale di tampone di lisi a 30 ml.
- Utilizzare un bicchiere douncer (40 ml) per omogeneizzare ulteriormente il tessuto e il libero nuclei. Eseguire otto colpi con un pestello gioco di grandi dimensioni.
- Passare il greggio isolare nuclei attraverso un 100 micron e 70 micron nylon mesh cellulare filtro (BD Biosciences), consecutivamente.
- Centrifugare la nuclei grezzo isolato in una centrifuga refrigerata (4 ° C) a 700 xg per 10 min.
- Rimuovere il surnatante attentamente invertendo i tubi e pulire l'interno del tubo con carta assorbente. Fare attenzione a non disturbare il pellet nuclei.
- Sciogliere il nuclei grezzo isolato in 5 ml di tampone saccarosio pipettando la soluzione più volte su e giù. Aggiungi un ulteriore 25 ml di tampone saccarosio alla disciolta pellet.
- Aggiungere 10 ml di tampone saccarosio appena preparato al tubo rivestito ultracentrifuga (vedi punto 1.1). </ Li>
- Accuratamente sovrapporre il aggiunti 10 ml di tampone saccarosio con i nuclei pellet risospeso sciolto in tampone saccarosio dal passaggio 1,9.
- Bilanciare le provette prima di metterli in un rotore JS13.1 libera oscillazione e posizionare il rotore in una centrifuga ad alta velocità (Beckman Avanti S-25).
- Spin il campione nuclei a 13.000 xga 4 ° C per 60 min.
- Quando la rotazione è stata completata, rimuovere i tubi accuratamente dal rotore e scartare il supernatante invertendo i tubi e pulire i detriti restante dall'interno dei tubi con carta assorbente.
- Sciogliere i nuclei pellet in 1 ml di tampone nuclei di stoccaggio (NSB più buffer). Nota: NSB più contiene 1,5 mM spermina come stabilizzante DNA.
- Procedere con il punto 2.1, immunocolorazione dei nuclei cardiomiociti.
2. Immunoenzimatica per Citometria a Flusso
- Preparare il controllo negativo per immunocolorazione. Prelevare un 'aliquota di 20 microlitri di fuori del campione nuclei edd 980 pl di tampone NSB più.
- Aggiungi anti-pericentriolar materiale 1 anticorpi (di coniglio anti-PCM-1, anticorpi Atlas) al campione nuclei in una diluizione di 1:500 per nuclei immunolabel cardiomiociti. Aggiungere l'anticorpo isotipo nella stessa diluizione come l'anti-anticorpo PCM-1 per il controllo negativo, preparato nella fase 2,1.
- Incubare controllo negativo e la provetta a 4 ° C per una notte.
- Lavare controllo negativo e campione almeno una volta con NSB più tampone (spin down tubi in una centrifuga refrigerata (4 ° C) a 700 xg per 10 min. Eliminare il surnatante e sciogliere il nuclei pellet in 1 ml di tampone più NSB).
- Aggiungi anti-coniglio immunofluorescenza secondario (FITC o APC) al controllo negativo e la provetta in una diluizione di 1:1000.
- Incubare controllo negativo e la provetta a 4 ° C per 1 h.
- Lavare controllo negativo e campione almeno una volta con NSB più tampone (spin down tubi in una centrifuga refrigerata (4 ° C) a 700 xg per 10 min. Gettare il surnatante e sciogliere i nuclei pellet in 1 ml di NSB più buffer).
- Procedere con l'analisi di citometria di flusso e di smistamento.
3. Citometria a Flusso
- Coat nuclei provette Falcon (15 ml) con 1% BSA / PBS soluzione prima di iniziare la citometria a flusso di smistamento come descritto al punto 1,1.
- Filtrare il campione e il controllo negativo tramite un setaccio cella 30 um e caricare il primo controllo negativo al citofluorimetro (Influx BD). Definire il primo cancello e la seconda per definire nuclei e canottiere (nuclei singola), sulla base di forward scatter (FSC), larghezza di impulso in avanti scatter (FS larghezza d'impulso) e Side Scatter (SSC) (Fig. 2a e b). Aggiunta di un DNA macchia (DRAQ5 (1:500)) per il campione può aiutare a identificare la popolazione nuclei inizialmente.
- Caricare il campione immunolabeled e definire la terza porta per isolare nuclei cardiomiociti (PCM-1-positve) da non-cardiomiociti nuclei (PCM-1-negativo). Avviare l'ordinamento(Fig. 2c e d).
Optional: Al fine di analizzare il contenuto nucleare di DNA (ploidia) e di eseguire l'analisi del ciclo cellulare aggiungere un DNA adeguato macchia per i nuclei (ad esempio, Hoechst 33342 o DRAQ5) (Fig. 2e).
- Dopo cernita citometria di flusso, posizionare i nuclei su ghiaccio e ri-analisi per determinare la purezza di smistamento (Fig. 3a e b).
- Centrifugare la nuclei ordinato nei tubi di raccolta a 1500 xg in una centrifuga refrigerata per 15 min.
- Sciogliere il nuclei pellet in un buffer compatibile con l'applicazione a valle.
4. Risultati rappresentativi
Nuclei morfologia e l'integrità può essere valutata attraverso macchie di DNA e visualizzati al microscopio (Fig. 1). Successo PCM-1 di etichettatura può essere valutata mediante microscopia in epifluorescenza e mediante citometria a flusso (Fig. 1 e Fig. 2c e d). PCM-1-positiVE e popolazioni negativi devono essere ben separati uno dall'altro (Fig. 2c e d). In murino ventricolo sinistro circa il 30% di tutti i nuclei dovrebbe essere nuclei cardiomiociti (Fig. 2d). Ordinamento purezza può essere valutata da ri-analizzando i nuclei ordinati (Fig. 3a e b). Entrambe le popolazioni nuclei dovrebbe avere una purezza superiore al 95% di smistamento.
Figura 1. PCM-1 identifica nuclei cardiomiociti. Nuclei cardiaca (a) vengono colorate con anticorpi anti PCM-1 (b) e per Nkx2.5 (c) in un cuore topo adulto. (D) PCM-1-marcato nuclei sono circondati da citoplasma cardiomiociti (catena pesante della miosina (MHC)) ed esprimere il fattore di trascrizione Nkx2.5, che documenta l'identificazione accurata dei nuclei cardiomiociti da PCM-1 colorazione (scala di 20 bar e 10 micron micron (d, inserto)). (E) isolati nuclei cardiache visualizzati con il DNA macchia DRAQ5. (F e G) Cardiomyocnuclei yte sono etichettati con anticorpi contro il PCM-1 (scala bar 10 micron). Nota, il pattern di colorazione epinuclear PCM-1 in nuclei muscolari in sezione del tessuto e in nuclei isolati (frecce).
Figura 2. Citometria a flusso ordinamento dei nuclei cardiomiociti. (A) nuclei Cardiac sono identificati dalla forward scatter (FSC) e lato scatter (SSC). (B) Una seconda porta identifica i singoli nuclei da FSC e FS larghezza di impulso 5. (C, d) gating fluorescente permette la separazione dei nuclei cardiomiociti (PCM-1-positive) e non-cardiomiociti (PCM-1-negativi) nuclei di tessuto cardiaco. (E) cardiomiociti mouse sono in gran parte (> 80%) diploide (2n), solo un piccolo sottoinsieme è tetraploide (4n) 6. Nota, cardiomiociti umani contengono una maggiore frequenza di nuclei poliploidia (> 2n) 7,8.
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Discussion
Identificazione accurata di nuclei cardiomiocita è cruciale per l'analisi dei processi rigenerativi nel miocardio 2,3. Le tecniche convenzionali per isolare cardiomiociti di tessuto fresco si basa principalmente sulla digestione enzimatica delle proteine della matrice extracellulare e la successiva purificazione dalle cellule interstiziali mediante centrifugazione a bassa velocità. Ulteriore purificazione di cardiomiociti viventi di cellule staminali embrionali (ESC) può essere eseguita da immunomarcatura con marcatori superficiali quali SIRPA 9 o coloranti mitocondriali 10, cardiomiociti fissi possono essere identificati dai marcatori citoplasmatici quali catena pesante della miosina (MHC) o proteine nucleari come GATA4 o Nkx2.5. Tuttavia, l'espressione di Nkx2.5 GATA4 e non è limitato a cardiomiociti maturi, ma può essere anche rilevata nelle cellule progenitrici durante lo sviluppo e dopo infarto cardiaco 11,12. Strategie genetiche per identificare cardiomiociti mostrare la più alta specificità, ma cAnnot essere applicato in modelli animali o esseri umani grandi 1. I limiti delle strategie esistenti hanno portato a conclusioni controverse basandosi sulla quantificazione di eventi rari, quali la proliferazione, l'apoptosi e chimerismo 1,13. Quindi, vi è la necessità di stabilire una strategia accurata per identificare e purificare maturo nuclei differenziata dei cardiomiociti.
Qui, si descrive una tecnica di purificazione basato su materiale pericentriolar 1 (PCM-1). In precedenza, abbiamo rafforzato la validità del nostro isolamento nuclei mostrando che tre marcatori indipendenti nucleari, PCM-1, la troponina cardiaca T e I, identificare la popolazione stessa dei cardiomiociti. 2,3 La popolazione purificato ha mostrato un arricchimento elevato di cardiomiociti prodotti genici specifici come come troponine cardiache, proteine della catena pesante della miosina e il fattore di trascrizione Nkx2.5 e GATA4 2,3.
Il protocollo attuale, basato sui PCM-1, è stato applicato con successo fo l'analisi di umano e di topo turnover cardiomyocyte 2,4 nonché per l'analisi del profilo cardiomiociti trascrizionale 2. Anticipiamo che la strategia presentata può anche essere adattato all'isolamento dei cardiomiociti da altre specie. PCM-1, una proteina centrosoma, ri-localizza la membrana nucleare cui si accumula e forma una matrice insolubile solo in miociti differenziati 2,14 (Fig. 1). Citometria di flusso consente l'analisi rapida corretto di un elevato numero di cellule, che è richiesto per quantificare eventi rari in cardiomiociti come apoptosi e ciclo cellulare rientro 15. Inoltre, analoghi nucleotidici (ad es BrdU) saggi di proliferazione base può essere facilmente applicato utilizzando la nostra tecnica presentato 4. La tecnica ha il vantaggio che il contenuto di DNA nuclei cardiomiociti singolo (nucleare ploidia) possono essere analizzati in cardiomiociti multinucleari 16,17, che fornisce informazioni importantidi discriminare tra cardiomiociti duplicazione e poliploidizzazione 6-8. Tuttavia, a causa della natura della nostra strategia, una caratterizzazione di multinucleazione cardiomiocita non è possibile.
Ulteriori applicazioni del metodo presentato sono studi focalizzati sui cambiamenti epigenetici della cromatina, nucleoproteine, interazioni protein-DNA/RNA e sul nucleare trascrittoma 18,19.
A causa della stabilità di nuclei in congelare scongelati-tessuto, la strategia di isolamento presentato nuclei possono essere applicati anche ai tessuti congelati, rendendo possibile utilizzare materiale archiviato da biobanche.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Ci piace riconoscere Marcelo Toro per l'assistenza con la citometria a flusso. Questo studio è stato sostenuto dalla svedese Heart-Lung Foundation e, Commissione UE FP7 "CardioCell", Consiglio svedese della ricerca, AFA assicurazioni e ALF. OB è stato sostenuto da Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Lysis Buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Sucrose buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 2.1 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.44 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM spermine | |||
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam | ||
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences | ||
| Glass douncer (40 ml) and pestle "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany | ||
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR | ||
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter | ||
| Influx cytometer | Beckman Coulter | ||
| Tube Rotator | VWR |
References
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