Isolering av Cardiomyocyte kjerner fra Post-mortem Tissue

Summary

Cardiac atomkjerner er isolert via tetthet sedimentering og immunolabeled med antistoffer mot pericentriolar materiale 1 (PCM-1) for å identifisere og sortere cardiomyocyte atomkjerner av flowcytometri.

Abstract

Identifisering av cardiomyocyte kjerner har vært utfordrende i vevsdelene som de fleste strategier stole bare på cytoplasmatiske markør proteiner ^1. Sjeldne hendelser i hjerte myocytes som spredning og apoptose kreve en nøyaktig identifisering av hjertestans myocyte atomkjerner til å analysere mobilnettet fornyelse i homeostase og patologiske tilstander ^2. Her gir vi en metode for å isolere cardiomyocyte atomkjerner fra post mortem vev av tetthet sedimentering og immunolabeling med antistoffer mot pericentriolar materiale 1 (PCM-1) og påfølgende flowcytometri sortering. Denne strategien gir en høy gjennomstrømming analyse og isolasjon med fordelen av å arbeide like godt på fersk vev og frossen arkivmateriale. Dette gjør det mulig å studere materiale som allerede er innsamlet i biobanker. Denne teknikken er anvendelig og testet i et bredt spekter av arter og egnet for flere nedstrøms applikasjoner som karbon-14 ³ dating, celle-CYcle ⁴ analyse, visualisering av tymidin analoger (f.eks BrdU og IDU) ^4, transkriptom og epigenetic analyse.

Protocol

1. Isolasjon av Cardiac kjernene

1. Coat Ultrasentrifuger rør (Beckman Sentrifugerør # 363664) med 10 ml 1% BSA / PBS belegg løsning. Cap rørene og la dem rotere i 30 min i en tube Rotator. Fjern belegget løsningen og la sentrifugerør luften tørr (en tube per mus hjerte kreves for analyse av enkle mus hjerter vekselsvis inntil 5 mus hjerter eller 1 g hjertet vev fra en annen art (f.eks menneske) kan behandles i en tube).
2. Alle følgende trinn skal utføres på is. Dissekere venstre hjertekammer fra fersk eller snap-frosne mus hjerte med en skalpell. Obs, er dette protokollen optimalisert for mus hjertet, men kan også tilpasses rotte eller menneskelig hjerte. Alternativt kan du bruke opp til 1 g hjertet vev fra en annen art.
3. Trim prøven i små avlukker med en skalpell.
4. Overfør vev brikker i et 50 ml Falcon rør fylt med 15 ml lysis buffer.
5. Homogeniserehjerte vev med en T-25 Ultra-Turrax probe homogenizer (IKA) på 24000 rpm i 10 sek.
6. Fortynn homogenat med lik volum av lysis buffer til 30 ml.
7. Bruk et glass douncer (40 ml) for ytterligere å homogenisere vevet og frigjør kjerner. Utfør åtte slag med en stor klaring stampe.
8. Før råolje kjerner isolere gjennom en 100 mikrometer og 70 mikrometer nylon mesh celle sil (BD Biosciences), fortløpende.
9. Spinn ned råoljen atomkjerner isolat i en nedkjølt sentrifuge (4 ° C) ved 700 xg i 10 min.
10. Fjern supernatanten forsiktig ved å snu rørene og tørk innsiden av røret med papirhåndkle. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer kjerner pellet.
11. Løs opp oljen atomkjerner isolere i 5ml av sukrose buffer ved å pipettere løsningen flere ganger opp og ned. Legg til en ytterligere 25 ml sukrose buffer til det oppløste pellet.
12. Tilsett 10 ml nylaget sukrose buffer til belagte Ultrasentrifuger røret (se trinn 1.1). </ Li>
13. Nøye overlappe ekstra 10 ml av sukrose buffer med resuspendert atomkjerner pellet oppløst i sukrose buffer fra trinn 1,9.
14. Balansere sentrifugerør før du legger dem inn i en JS13.1 frittsvingende rotor og plasser rotoren inn i en høyhastighets sentrifuge (Beckman Avanti S-25).
15. Spinn kjerner prøven på 13 000 xg ved 4 ° C i 60 min.
16. Når spin er fullført, fjerner rørene nøye fra rotoren og kast supernatanten ved å snu rørene og tørke resterende rusk fra innsiden av rørene med tørkepapir.
17. Løs opp atomkjerner pellet i 1 ml av kjerner lagring buffer (NSB pluss buffer). Merk: NSB pluss inneholder 1,5 mM spermine som en DNA stabilisator.
18. Fortsett med trinn 2.1, farging av cardiomyocyte kjerner.

2. Farging for flowcytometrisystemer

1. Klargjør den negative kontrollen for farging. Ta en delmengde av 20 mL ut av kjerner prøven og endd 980 mL av NSB pluss buffer.
2. Legg anti-pericentriolar materiale en antistoff (kanin anti-PCM-1, Atlas Antistoffer) til atomkjerner prøven i en utvanning av 1:500 til immunolabel cardiomyocyte kjerner. Legg til isotype antistoff i samme fortynning som anti-PCM-1 antistoff til negativ kontroll, utarbeidet i trinn 2.1.
3. Inkuber negativ kontroll og prøverør ved 4 ° C over natten.
4. Vask negativ kontroll og prøve minst en gang med NSB pluss buffer (spinner ned rør i en nedkjølt sentrifuge (4 ° C) ved 700 xg i 10 min. Kast supernatant og oppløse kjerner pellet i 1 ml av NSB pluss buffer).
5. Legg anti-kanin fluorescerende sekundært antistoff (FITC eller APC) til negativ kontroll og prøverør i en fortynning av 1:1000.
6. Inkuber negativ kontroll og prøverør ved 4 ° C i 1 time.
7. Vask negativ kontroll og prøve minst en gang med NSB pluss buffer (spinner ned rør i en nedkjølt sentrifuge (4 ° C) ved 700 xg i 10 min. Kast supernatant og oppløse kjerner pellet i 1 ml av NSB pluss buffer).
8. Fortsett med flowcytometrisk analyse og sortering.

3. Flowcytometrisystemer

1. Coat kjerner samling rør (Falcon 15 ml) med 1% BSA / PBS-løsning før du begynner flowcytometri sortering som beskrevet i trinn 1.1.
2. Filtrer prøven og den negative kontrollen gjennom en 30 mikrometer celle sil og legg først negative kontrollen til flowcytometeret (BD Tilstrømningen). Definer første og andre gate for å definere kjerner og Singleter (single atomkjerner), basert på fremover scatter (FSC), frem strø pulsbredde (FS pulsbredde) og side scatter (SSC) (Fig. 2a og b). Legge til en DNA flekk (DRAQ5 (1:500)) til prøven kan bidra til å identifisere kjerner befolkningen i utgangspunktet.
3. Legg immunolabeled prøven og definere den tredje porten for å isolere cardiomyocyte kjerner (PCM-1-positve) fra ikke-cardiomyocyte kjerner (PCM-1-negative). Start sortering(Fig. 2c og d).

Valgfritt: For å analysere den kjernefysiske DNA innhold (ploiditet) og å utføre cellesyklus analyse legger en passende DNA stain til kjerner (f.eks Hoechst 33342 eller DRAQ5) (Fig. 2e).

4. Etter flowcytometri sortering, plasser kjerner på is og re-analysere å bestemme sortering renhet (Fig. 3a og b).
5. Spinn ned sortert atomkjerner i samlingen rørene ved 1500 xg i en nedkjølt sentrifuger i 15 min.
6. Løs opp atomkjerner pellet i en buffer forenlig med nedstrøms søknaden.

4. Representative Resultater

Atomkjerner morfologi og integritet kan vurderes ved DNA flekker og visualisert ved mikroskopi (Fig. 1). Vellykket PCM-1 merking kan vurderes ved epifluorescence mikroskopi og ved flowcytometri (Fig. 1 og Fig. 2c og d). PCM-1-posive og negative populasjoner bør være godt atskilt fra hverandre (Fig. 2c og d). I murint venstre hjertekammer ca 30% av alle kjerner bør være cardiomyocyte kjerner (Fig. 2d). Sortering renhet kan vurderes ved re-analysere sortert kjerner (Fig. 3a og b). Begge kjerner populasjoner bør ha en sortering av renhet overstiger 95%.

Figur 1. PCM-en identifiserer cardiomyocyte kjerner. Cardiac kjerner (a) er farget med antistoffer mot PCM-1 (b) og til Nkx2.5 (c) i en voksen mus hjerte. (D) PCM-1-merket kjerner er omgitt av cardiomyocyte cytoplasma (myosin heavy chain (MHC)) og uttrykke transkripsjonsfaktor Nkx2.5, dokumentere nøyaktig identifisering av cardiomyocyte kjerner av PCM-1 flekker (skala barer 20 mikrometer og 10 mikrometer (d, innfelt)). (E) Hjertesykdommer kjerner isolater visualisert med DNA flekken DRAQ5. (F og g) Cardiomyocyte atomkjerner er merket med antistoffer mot PCM-1 (skala bar 10 mikrometer). Obs, det epinuclear farging mønster av PCM-1 i myocyte atomkjerner i vev avsnitt og i isolerte kjerner (piler).

Figur 2. Flowcytometrisk sortering av cardiomyocyte kjerner. (A) Cardiac atomkjerner er identifisert med fremover scatter (FSC) og side scatter (SSC). (B) En annen gate identifiserer singel atomkjerner av FSC og FS pulsbredde ^5. (C, d) Fluoriserende gating tillater separasjon av cardiomyocyte kjerner (PCM-1-positive) og ikke-cardiomyocyte (PCM-1-negative) kjerner fra hjertet vev. (E) Mouse cardiomyocyte er for det meste (> 80%) diploid (2n), er bare en liten undergruppe tetraploid (4N) ^6. Obs, menneskelige cardiomyocytes inneholde en høyere frekvens av polyploidi kjerner (> 2n) ^7,8.

Discussion

Nøyaktig identifisering av cardiomyocyte kjerner er avgjørende for analyse av regenerative prosesser i hjertemuskelen ^2,3. Konvensjonelle teknikker for å isolere cardiomyocytes fra frisk vev er hovedsakelig basert på enzymatisk nedbrytning av ekstracellulær matrix proteiner og den påfølgende rensing fra interstitielle celler ved lav hastighet sentrifugering. Ytterligere rensing av levende cardiomyocytes fra embryonale stamceller (ESC) kan utføres ved immunolabeling med overflate markører som Sirpa ⁹ eller mitokondrielle fargestoffer ^10, kan faste cardiomyocytes bli identifisert av cytoplasmatiske markører som myosin heavy chain (MHC) eller kjernefysiske proteiner som GATA4 eller Nkx2.5. Imidlertid er det uttrykk for Nkx2.5 og GATA4 ikke begrenset til modne cardiomyocytes, men kan også påvises i stamceller under utvikling og etter hjerteinfarkt ^11,12. Genetiske strategier for å identifisere cardiomyocytes vise høyest spesifisitet, men cAnnot brukes i store dyremodeller og mennesker ^1. Begrensningene i de eksisterende strategier har ført til kontroversielle konklusjoner baserer seg på kvantifisering av sjeldne hendelser som spredning, apoptose og chimerism ^1,13. Dermed er det behov for å etablere en nøyaktig strategi for å identifisere og rense moden differensiert cardiomyocyte kjerner.

Her beskriver vi en renselse teknikk basert på pericentriolar materiale 1 (PCM-1). Tidligere styrket vi gyldigheten av vår kjerner isolasjon ved å vise at tre uavhengige kjernefysiske markører, PCM-1, kardial troponin T og I, identifisere den samme cardiomyocyte befolkningen. ^2,3 Den rensede befolkningen viste en høy anrikning av cardiomyocyte spesifikke genprodukter slik som kardiale troponins og myosin heavy chain protein og transkripsjonsfaktor Nkx2.5 og GATA4 ^2,3.

Den nåværende protokoll, basert på PCM-1, har blitt brukt feller analyse av menneskelige og mus cardiomyocyte omsetningen ^2,4 samt for analyse av cardiomyocyte transcriptional profilen ^to. Vi forventer at den fremlagte strategien kan også tilpasses til isolering av cardiomyocytes fra andre arter. PCM-1, en ​​sentrosomen protein, re-lokaliserer til den kjernefysiske membranen hvor det akkumulerer og danner et uløselig matrix bare i differensierte myocytes ^2,14 (Fig. 1). Flowcytometri gir rask objektiv analyse av et høyt antall celler, som er nødvendig for å kvantifisere sjeldne hendelser i cardiomyocytes som apoptose og cellesyklus re-entry ^15. Videre nukleotidanaloger (f.eks BrdU) baserte spredning analysene kan lett påføres med vår presentert teknikk ^4. Vår teknikk har den fordelen at DNA innhold enkelt cardiomyocyte kjerner (kjernefysisk ploiditet) kan analyseres i multinuclear cardiomyocytes ^16,17, som inneholder viktig informasjonå diskriminere mellom cardiomyocyte dobbeltarbeid og polyploidisation ^6-8. Men på grunn av naturen av vår strategi, er en karakteristikk av cardiomyocyte multinucleation ikke mulig.

Ytterligere anvendelser av presenterte metoden er studiene fokuserte på epigenetic endringer av kromatin, nucleoproteiner og protein-DNA/RNA interaksjoner og på den kjernefysiske transkriptom ^18,19.

På grunn av stabiliteten av kjerner i fryse-tint vev, kan det presenteres kjerner isolert strategi også brukes til frosne vev, noe som gjør det mulig å utnytte arkiverte materiale fra biobanker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Lysis Buffer
Name of the reagent
0.32 M sucrose
10 mM Tris-HCl (pH = 8)
5 mM CaCl2
5 mM magnesium acetate
2.0 mM EDTA
0.5 mM EGTA
1 mM DTT
2. Sucrose buffer
Name of the reagent
2.1 M sucrose
10 mM Tris-HCl (pH = 8)
5 mM magnesium acetate
1 mM DTT
3. Nuclei storage buffer (NSB plus)
Name of the reagent
0.44 M sucrose
10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)
70 mM KCl
10 mM MgCl2
1.5 mM spermine
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415	Abcam
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374	Atlas Antibodies
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody	Life Technologies
DRAQ5	Biostatus
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm	BD Biosciences
Glass douncer (40 ml) and pestle "L"	VWR (Wheaton Industries Inc.)
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer	IKA Germany
Dispersing tool S25 N-18 G	IKA Germany
Beckman Avanti Centrifuge	Beckman Coulter
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml	VWR
Beckman Centrifuge Tubes #363664	Beckman Coulter
JS13.1 free swinging rotor	Beckman Coulter
Influx cytometer	Beckman Coulter
Tube Rotator	VWR