Summary
Núcleos cardíaca são isolados através de sedimentação densidade e immunolabeled com anticorpos contra o material pericentriolar 1 (PCM-1) para identificar e classificar os núcleos dos cardiomiócitos por citometria de fluxo.
Abstract
Identificação de núcleos de cardiomiócitos tem sido um desafio em cortes de tecido como a maioria das estratégias de contar apenas com proteínas marcadoras citoplasmáticos 1. Eventos raros em miócitos cardíacos, tais como a proliferação e apoptose necessitam de uma identificação precisa dos núcleos dos miócitos cardíacos para analisar a renovação celular e na homeostasia em condições patológicas 2. Aqui, nós proporcionar um método para isolar a partir de núcleos de cardiomiócitos pós tecido mortem por sedimentação densidade e imunomarcação com anticorpos contra o material pericentriolar 1 (PCM-1) e triagem de citometria de fluxo posterior. Esta estratégia permite uma análise com rendimento elevado e de isolamento, com a vantagem de se trabalhar igualmente bem em tecido fresco e material de arquivo congelado. Isto torna possível estudar o material já recolhidos na biobancos. Esta técnica é aplicável e testado em uma vasta gama de espécies e adequados para várias aplicações tais como a jusante de carbono-14 namoro 3, a célula-cycle análise 4, visualização de análogos da timidina (por exemplo, BrdU e UDI) 4, a análise de transcriptoma e epigenética.
Protocol
1. Isolamento dos Núcleos Cardiac
- Revestimento tubos de ultracentrifugação (Tubos centrífuga Beckman # 363664) com 10 ml de solução de revestimento de 1% BSA / PBS. Tapar os tubos e deixá-los girar durante 30 min num rotor tubo. Remover a solução de revestimento e deixar que o tubos de centrifugação de ar seco (um tubo por coração do rato é necessária para a análise de corações de rato individuais, alternadamente até 5 corações de rato ou 1 g de tecido do coração a partir de uma espécie diferente (por exemplo, humanos) podem ser processados em um tubo).
- Todos os passos seguintes devem ser realizados no gelo. Dissecar o ventrículo esquerdo do coração de rato fresco ou congelado snap-com um bisturi. Nota, este protocolo é optimizado para coração de rato, mas também pode ser adaptado para rato ou do coração humano. Alternativamente, usam-se a 1 g de tecido do coração a partir de uma espécie diferente.
- Apare o espécime em cubículos pequenos, com um bisturi.
- Transfira os pedaços de tecido em um tubo Falcon 50 ml cheia com 15 ml de tampão de lise.
- Homogeneizar atecido do coração com uma T-25 Ultra-Turrax sonda homogeneizador (IKA) com 24.000 rpm durante 10 seg.
- Diluir o homogeneizado com um volume igual de tampão de lise a 30 ml.
- Utilizar um vidro douncer (40 ml) para continuar a homogeneizar o tecido e os núcleos livre. Executar oito traçados com um pilão de grande folga.
- Passe o núcleo bruto isolar através de um 100 mm e 70 mM de nylon de malha de células do filtro (BD Biosciences), consecutivamente.
- Girar para baixo os núcleos isolado bruto numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 700 xg durante 10 min.
- Remover o sobrenadante cuidadosamente por inversão dos tubos e limpar o interior do tubo com uma toalha de papel. Tenha cuidado para não perturbar o pellet núcleos.
- Dissolve-se o isolado bruto núcleos em 5ml de tampão de sacarose por pipetagem a solução várias vezes para cima e para baixo. Adicionar mais 25 ml de tampão de sacarose para o sedimento dissolvido.
- Adicionar 10 ml de tampão de sacarose recentemente preparada para o tubo de ultracentrifuga revestido (ver passo 1.1). </ Li>
- Cuidadosamente sobrepor a 10 ml adicional de tampão de sacarose, com a ressuspenso núcleos sedimento dissolvido em tampão de sacarose a partir do passo 1.9.
- Equilibrar os tubos de centrifugação antes de os colocar num rotor JS13.1 livre oscilante e colocar o rotor em uma centrífuga de alta velocidade (Beckman Avanti-S 25).
- Girar a amostra núcleos em 13.000 xg, a 4 ° C durante 60 min.
- Quando a rotação foi concluída, remover os tubos cuidadosamente a partir do rotor e descartar o sobrenadante por inversão dos tubos e limpando os detritos remanescente a partir do interior dos tubos com toalha de papel.
- Dissolve-se o pellet núcleos em 1 ml de tampão de núcleos de armazenamento (NSB mais tampão). Nota: NSB plus contém 1,5 mM espermina na forma de um estabilizador de DNA.
- Prossiga com o passo 2.1, imunocoloração de núcleos de cardiomiócitos.
2. A imunocoloração para Citometria de Fluxo
- Prepare o controlo negativo para a imunocoloração. Tomar uma alíquota de 20 uL para fora da amostra núcleos e umadd ul 980 de NSB mais buffer.
- Adicionar anti-pericentriolar material de um anticorpo (anticorpo de coelho anti-PCM-1, Antibodies Atlas) para a amostra núcleos em uma diluição de 1:500 a immunolabel núcleos de cardiomiócitos. Adicionar o anticorpo de isotipo para a diluição mesmo que o anticorpo anti-PCM-1 para o controlo negativo, preparado no passo 2.1.
- Incubar controlo negativo e tubo de amostra a 4 ° C durante a noite.
- Lavar controlo negativo e amostra, pelo menos, uma vez com NSB mais tampão (tubos de girar para baixo numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 700 xg durante 10 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender o pellet núcleos em 1 ml de tampão mais NSB).
- Adicionar anti-coelho de anticorpo fluorescente secundário (FITC ou APC) para controlo negativo e tubo de amostra em uma diluição de 1:1000.
- Incubar controlo negativo e tubo de amostra a 4 ° C durante 1 h.
- Lavar controlo negativo e amostra, pelo menos, uma vez com NSB mais tampão (tubos de girar para baixo numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 700 xg durante 10 min. Descartar o sobrenadante e dissolver os núcleos sedimento em 1 ml de tampão mais NSB).
- Continuar com a análise por citometria de fluxo e triagem.
3. Citometria de Fluxo
- Revestimento tubos núcleos de recolha (Falcon de 15 ml) com 1% de solução de BSA / PBS antes de começar a citometria de fluxo de triagem, tal como descrito no passo 1,1.
- Filtrar a amostra eo controlo negativo através de um filtro 30 uM célula e carregar primeiro o controlo negativo para o citómetro de fluxo (afluxo BD). Definir o portão primeiro e segundo para definir núcleos e singuletos (núcleos único), com base na dispersão para a frente (FSC), largura de pulso para a frente de dispersão (FS largura de pulso) e dispersão lateral (SSC) (Fig. 2a e b). Adicionando um DNA mancha (DRAQ5 (1:500)) para a amostra pode ajudar a identificar a população núcleos inicialmente.
- Carregar a amostra immunolabeled e definir a terceira porta para isolar os núcleos dos cardiomiócitos (PCM-1-positve) de não-cardiomiócitos núcleos (PCM-1-negativo). Inicie a triagem(Fig. 2c, d).
Opcional: A fim de analisar o conteúdo de DNA nuclear (ploidia) e para executar a análise do ciclo celular adicionar uma mancha de DNA adequado para os núcleos (por exemplo, Hoechst 33342 ou DRAQ5) (fig. 2e).
- Após a triagem de citometria de fluxo, colocar os núcleos em gelo e re-analisar para determinar a pureza de classificação (Fig. 3a e b).
- Girar para baixo os núcleos classificados nos tubos de recolha a 1500 xg numa centrifugadora refrigerada durante 15 min.
- Dissolve-se o pellet núcleos num tampão compatível com a aplicação a jusante.
4. Os resultados representativos
Morfologia núcleos e integridade pode ser avaliada por manchas de DNA e visualizada por microscopia (Fig. 1). Bem sucedida PCM-1 rotulagem pode ser avaliado por microscopia de epifluorescência e por citometria de fluxo (Fig. 1 e Fig.. 2c e d). PCM-1-positive e populações negativas devem ser bem separadas umas das outras (Fig. 2c, d). Em ventrículo esquerdo murino cerca de 30% de todos os núcleos deve ser os núcleos dos cardiomiócitos (Fig. 2d). Triagem pureza pode ser avaliada por re-analisando os núcleos ordenadas (Fig. 3a e b). Ambas as populações núcleos deve ter uma pureza superior a 95% de triagem.
Figura 1. PCM-1 identifica os núcleos dos cardiomiócitos. Núcleos Cardíaca (a) são coradas com anticorpos para PCM-1 (b), e para Nkx2.5 (c) em um coração de rato adulto. (D) PCM-1-rotulado núcleos são cercados por citoplasma dos cardiomiócitos (miosina de cadeia pesada (MHC)) e expressar o fator de transcrição Nkx2.5, documentando a identificação precisa de núcleos de cardiomiócitos pelo PCM-1 coloração (barras de escala 20 microns e 10 iM (d, inserção)). (E) isolados núcleos cardíacas visualizado com o DNA mancha DRAQ5. (Feg) Cardiomyocnúcleos YTE são rotulados com anticorpos contra PCM-1 (barra de escala 10 mm). Note, o padrão de coloração epinuclear de PCM-1 em núcleos dos miócitos em secção de tecido e em núcleos isolados (setas).
Figura 2. Classificação por citometria de fluxo de núcleos de cardiomiócitos. (A) núcleos cardíaca são identificados por dispersão frontal (FSC) e dispersor lateral (SSC). (B) Um segundo portão identifica núcleos único pelo FSC e largura de pulso FS 5. (C, d) gating fluorescente permite a separação de núcleos de cardiomiócitos (PCM-1-positivo) e não-cardiomiócitos (PCM-1-negativa) núcleos a partir de tecido do coração. (E) cardiomiócito do rato são na maior parte (> 80%) diplóide (2n), apenas um pequeno subconjunto é tetraplóide (4n) 6. Note, cardiomiócitos humanos contêm uma maior frequência de núcleos poliploidia (> 2n) 7,8.
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Discussion
A identificação precisa de núcleos de cardiomiócitos é crucial para a análise dos processos regenerativos no miocárdio 2,3. As técnicas convencionais para isolar cardiomiócitos de tecido fresco baseiam-se principalmente a digestão enzimática de proteínas da matriz extracelular e da subsequente purificação a partir de células intersticiais por centrifugação a baixa velocidade. A purificação adicional de cardiomiócitos de vida a partir de células estaminais embrionárias (ESC) pode ser realizada por imunomarcação com marcadores de superfície tais como Sirpa 9 ou corantes mitocondriais 10, cardiomiócitos fixas podem ser identificados por meio de marcadores, tais como citoplasmáticos miosina de cadeia pesada (MHC) ou proteínas nucleares, tais como GATA4 ou Nkx2.5. No entanto, a expressão de Nkx2.5 e GATA4 não se restringe a cardiomiócitos maduras, mas pode ser também detectada em células progenitoras durante o desenvolvimento e após enfarte cardíaco 11,12. Estratégias genéticas para identificar cardiomiócitos mostrar a maior especificidade, mas cannot ser aplicada em modelos animais ou seres humanos grandes 1. As limitações das estratégias existentes, levaram a conclusões controversas que dependem da quantificação de eventos raros, como apoptose, proliferação e quimerismo 1,13. Assim, existe uma necessidade de estabelecer uma estratégia precisas para identificar e purificar os núcleos dos cardiomiócitos madura diferenciada.
Aqui, nós descrevemos uma técnica de purificação com base em material pericentriolar 1 (PCM-1). Anteriormente, reforçou a validade do nosso isolamento núcleos, mostrando que três marcadores independentes nucleares, PCM-1, troponina T e I, identificar a mesma população de cardiomiócitos. 2,3 A população purificada apresentou um enriquecimento elevado de cardiomiócitos produtos de genes específicos, tais como troponinas cardíacas, proteína miosina de cadeia pesada e do fator de transcrição Nkx2.5 e GATA4 2,3.
O protocolo atual, baseado em PCM-1, foi aplicada com sucesso fou a análise de humano e ratinho volume de cardiomiócitos 2,4, bem como para a análise do perfil de cardiomiócitos transcricional 2. Prevemos que a estratégia apresentada pode também ser adaptado para o isolamento de cardiomiócitos de outras espécies. PCM-1, uma proteína centrossoma, re-localiza-se à membrana nuclear, onde se acumula e forma uma matriz insolúvel apenas em miócitos diferenciadas 2,14 (fig. 1). A citometria de fluxo permite a análise rápida imparcial de um número elevado de células, o que é necessário para quantificar eventos raros em cardiomiócitos, tais como a apoptose e ciclo celular re-entrada 15. Além disso, análogos de nucleótidos (por exemplo, BrdU) ensaios de proliferação base pode ser prontamente aplicado utilizando o nosso técnica apresentada 4. A nossa técnica tem a vantagem de que o conteúdo de DNA de núcleos de cardiomiócitos única (ploidia nuclear) pode ser analisada em cardiomiócitos multinucleadas 16,17, o que proporciona informação importantea discriminar entre a duplicação dos cardiomiócitos e polyploidisation 6-8. No entanto, devido à natureza da nossa estratégia, uma caracterização de multinucleação cardiomiócitos não é possível.
Outras aplicações do método apresentado são estudos focados em mudanças epigenéticas da cromatina, nucleoproteínas, interações protein-DNA/RNA e sobre o transcriptoma nuclear 18,19.
Devido à estabilidade de núcleos em congelar-descongelado tecido, a estratégia de isolamento apresentavam núcleos podem também ser aplicados aos tecidos congelados, tornando-se possível utilizar material arquivado a partir de biobancos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Nós gostamos de reconhecer Marcelo Toro para a assistência com a citometria de fluxo. Este estudo foi financiado pelo sueco Coração e Pulmão Foundation, da Comissão Européia, FP7 "CardioCell", Sueco de Pesquisa do Conselho, seguros AFA e ALF. OB foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Lysis Buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Sucrose buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 2.1 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.44 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM spermine | |||
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam | ||
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences | ||
| Glass douncer (40 ml) and pestle "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany | ||
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR | ||
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter | ||
| Influx cytometer | Beckman Coulter | ||
| Tube Rotator | VWR |
References
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