Summary
Hj Kärnor isoleras via densitet sedimentering och immunolabeled med antikroppar mot pericentriolar materialet 1 (PCM-1) för att identifiera och sortera kardiomyocyter kärnor med flödescytometri.
Abstract
Identifiering av kardiomyocetisk kärnor har varit en utmaning i vävnadssnitt som de flesta strategierna förlita sig enbart på cytoplasmiska markörproteiner 1. Sällsynta händelser i hjärtmuskelceller som proliferation och apoptos kräver en noggrann kartläggning av hjärtmuskelceller kärnor för att analysera cellulära förnyelse i homeostas och patologiska tillstånd 2. Här ger vi en metod för att isolera kardiomyocetisk kärnor från post mortem vävnad genom täthet sedimentering och immunomärkning med antikroppar mot pericentriolar material 1 (PCM-1) och efterföljande flödescytometri sortering. Denna strategi gör det möjligt för en hög genomströmning analys och isolering med fördelen att arbeta lika bra på färsk vävnad och fryst arkivmaterial. Detta gör det möjligt att studera material som redan samlats in i biobanker. Denna teknik är tillämplig och testas i ett brett spektrum av arter och passar för flera nedströms applikationer såsom kol-14 datering 3, cell-cyCLE Analys 4, visualisering av tymidinanaloger (t.ex. BrdU och IDU) 4, transkriptom och epigenetiska analys.
Protocol
1. Isolering av Cardiac Kärnor
- Belägga ultracentrifugrör (Beckman Centrifugrör # 363664) med 10 ml av 1% BSA / PBS beläggningslösning. Förslut rören och låt dem rotera under 30 min i ett rör rotator. Avlägsna beläggningslösningen och låta centrifugrör lufttorka (ett rör per mushjärta erfordras för analys av enstaka mus hjärtan, alternativt upp till 5 hjärtan från mus eller 1 g av hjärtvävnad från en annan art (t.ex. människa) kan bearbetas i ett rör).
- Alla följande åtgärder bör genomföras på is. Dissekera den vänstra ventrikeln av färsk eller snabbfrystes mushjärta med en skalpell. Observera att detta protokoll optimerad för mushjärta men kan också anpassas till råtta eller humant hjärta. Alternativt kan du använda upp till 1 g hjärtats vävnad från en annan art.
- Trimma provet i små skåp med en skalpell.
- Överföra vävnadsbitar i en 50 ml Falcon-rör fyllt med 15 ml lysbuffert.
- Homogeniserahjärtvävnad med en T-25 Ultra-Turrax-sond homogenisator (IKA) vid 24.000 varv per minut under 10 sek.
- Späd homogenatet med lika stor volym av lysbuffert till 30 ml.
- Använda ett glas douncer (40 ml) för att ytterligare homogenisera vävnaden och befria kärnor. Utföra åtta slag med en stor frigång mortelstöt.
- Passera den råa kärnorna isolera genom en 100 nm och 70 nm nylonnät cellfilter (BD Biosciences), följd.
- Centrifugera ner den råa kärnor isolera i en kyld centrifug (4 ° C) vid 700 xg under 10 min.
- Avlägsna supernatanten försiktigt genom att rören vändes upp och torka insidan av röret med en pappershandduk. Var noga med att inte störa kärnorna pelleten.
- Lös den råa kärnorna isolera i 5 ml av sackaros-buffert genom att pipettera lösningen flera gånger upp och ned. Tillsätt ytterligare 25 ml av sackaros-buffert till den lösta pelleten.
- Tillsätt 10 ml nyberedd sackaros-buffert till den belagda ultracentrifugrör (se steg 1.1). </ Li>
- Noggrant överlagra den tillsatta 10 ml sackarosbuffert med den återsuspenderade kärnor pelleten upplöstes i sackarosbuffert från steg 1,9.
- Balansera centrifugrören innan de släpps ut i en JS13.1 fritt svängande rotor och placera rotorn till en hög hastighet centrifug (Beckman Avanti S-25).
- Snurra kärnorna provet vid 13.000 xg vid 4 ° C under 60 minuter.
- Om kulan har fullbordats avlägsna rören noggrant från rotorn och kasta bort supernatanten genom att vända rören och torka den återstående rester från insidan av rören med en pappershandduk.
- Upplösa kärnorna pelleten i 1 ml av kärnor lagringsbuffert (NSB plus buffert). Obs: NSB plus innehåller 1,5 mM spermin som en DNA-stabilisator.
- Fortsätt med steg 2,1, immunfärgning av kardiomyocetisk kärnor.
2. Immunfärgning för flödescytometri
- Framställa den negativa kontrollen för immunfärgning. Tag en alikvot om 20 | il av kärnorna provet och endd 980 | il av NSB plus buffert.
- Lägg anti-pericentriolar materialet 1-antikropp (kanin-anti-PCM-1, Atlas Antibodies) till kärnor provet i en utspädning av 1:500 till immunolabel kardiomyocetisk kärnor. Tillsätt isotyp-antikropp på samma utspädning som anti-PCM-1-antikropp till den negativa kontrollen, som framställts i steg 2.1.
- Inkubera negativ kontroll och provröret vid 4 ° C över natten.
- Tvätta negativ kontroll och prov åtminstone en gång med NSB plus buffert (centrifugera ner rören i en kyld centrifug (4 ° C) vid 700 xg under 10 minuter. Kasta supernatanten och lös upp kärnorna pelleten i 1 ml NSB plus buffert).
- Lägg anti-kanin fluorescerande sekundär antikropp (FITC eller APC) till negativ kontroll och provrör i en utspädning om 1:1000.
- Inkubera negativ kontroll och provröret vid 4 ° C under 1 timme.
- Tvätta negativ kontroll och prov åtminstone en gång med NSB plus buffert (centrifugera ner rören i en kyld centrifug (4 ° C) vid 700 xg under 10 minuter. Kassera supernatant och lös kärnorna pelleten i 1 ml NSB plus buffert).
- Fortsätt med flödescytometrisk analys och sortering.
3. Flödescytometri
- Coat kärnor Uppsamlingsrör (Falcon 15 ml) med 1% BSA / PBS-lösning innan du börjar flödescytometri sortering som beskrivs i steg 1,1.
- Filtrera provet och den negativa kontrollen genom en 30 m cellfilter och ladda först negativa kontrollen till flödescytometern (BD inflöde). Definiera den första och den andra grinden för att definiera kärnor och singletter (inre kärna), baserat på framåtspridning (FSC) framåtspridning pulsbredd (FS pulsbredd) och sidospridning (SSC) (fig 2a och b). Lägga till en DNA-färgning (DRAQ5 (1:500)) för att provet kan hjälpa till att identifiera kärnan befolkningen början.
- Fyll på immunolabeled provet och definierar den tredje porten för att isolera kardiomyocetisk kärnor (PCM-1-positve) från icke-kardiomyocetisk kärnor (PCM-1-negativa). Starta sortering(Fig. 2c och d).
Tillval: För att analysera den nukleära DNA-innehåll (ploidi) och att utföra analyser cellcykeln lägga en lämplig DNA-fläcken kärnorna (t.ex. Hoechst 33342 eller DRAQ5) (Fig. 2e).
- Efter flödescytometri sortering, placera kärnan på is och re-analys för att bestämma renheten sortering (fig 3a och b).
- Centrifugera ner den sorterade kärnorna i de uppsamlingsrör vid 1500 x g i en kyld centrifug under 15 min.
- Upplösa kärnor pelleten i en buffert som är kompatibel med den nedströms belägna ansökan.
4. Representativa resultat
Kärnor morfologi och integritet kan bedömas genom DNA-fläckar och visualiseras i mikroskop (Fig. 1). Framgångsrik PCM-1 märkning kan bedömas genom epifluorescensmikroskopi och flödescytometri (Fig. 1 och Fig.. 2c och d). PCM-1-positive och negativa populationer bör vara väl separerade från varandra (fig. 2c och d). I mus vänster kammare ca 30% av alla kärnor skall vara kardiomyocetisk kärnor (Fig. 2d). Sortering renhet kan bedömas genom åter analysera sorterade kärnor (Fig. 3a och b). Båda kärnor populationer bör ha en sortering av renhet är bättre än 95%.
Figur 1. PCM-1 identifierar kardiomyocetisk kärnor. Cardiac kärnor (a) färgas med antikroppar mot PCM-1 (b) och Nkx2.5 (c) i en vuxen mus hjärta. (D) PCM-1-märkta kärnor omgivna av kardiomyocetisk cytoplasma (myosin tung kedja (MHC)) och uttrycker transkriptionsfaktor Nkx2.5, dokumentera exakt identifiering av kardiomyocetisk kärnor med PCM-1 färgning (skala bar 20 m och 10 im (d, infälld)). (E) Hjärtat kärnor isolat visualiserade med DNA fläcken DRAQ5. (F och g) Cardiomyocyte kärnor är märkta med antikroppar mot PCM-1 (skala bar 10 m). Notera, att epinuclear färgningsmönster av PCM-1 i myocyt kärnor i vävnadssnitt och isolerade kärnor (pilar).
Figur 2. Flödescytometrisk sortering av kardiomyocyter kärnor. (En) Cardiac kärnor identifieras genom framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC). (B) En andra porten identifierar enstaka kärnor av FSC och FS pulsbredd 5. (C, d) Fluorescerande grindning tillåter separation av kardiomyocyter kärnor (PCM-1-positiva) och icke-kardiomyocyter (PCM-1-negativa) kärnor från hjärtvävnaden. (E) Mus kardiomyocetisk är oftast (> 80%) diploida (2n) är endast en liten delmängd tetraploid (4n) 6. Observera mänskliga hjärtmuskelceller innehåller en högre frekvens av polyploidi kärnor (> 2n) 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Exakt identifiering av kardiomyocetisk kärnor är avgörande för analys av regenerativa processer i hjärtmuskeln 2,3. Konventionella tekniker för att isolera kardiomyocyter från färsk vävnad är huvudsakligen baserade på enzymatisk digestion av extracellulära matrisproteiner och efterföljande rening av interstitiella celler genom centrifugering vid låg hastighet. Ytterligare rening av levande hjärtmuskelceller från embryonala stamceller (ESC) kan utföras av immunomärkning med ytmarkörer som Sirpa 9 eller mitokondriella färgämnen 10, kan fasta hjärtmuskelceller identifieras genom cytoplasmatiska markörer som myosin tung kedja (MHC) eller nukleära proteiner såsom GATA4 eller Nkx2.5. Emellertid är uttrycket av Nkx2.5 och GATA4 inte begränsad till mogna kardiomyocyter, men kan också detekteras i progenitorceller under utvecklingen och efter hjärtinfarkt 11,12. Genetiska strategier för att identifiera hjärtmuskelceller visa den högsta specificiteten, men CAnnot tillämpas i stora djurmodeller och människor 1. Begränsningarna i de befintliga strategierna har lett till kontroversiella slutsatser som förlitar sig på en kvantifiering av sällsynta händelser såsom proliferation, apoptos och chimerism 1,13. Således finns det ett behov av att upprätta en korrekt strategi för att identifiera och rena mogna differentierade kardiomyocetisk kärnor.
Här beskriver vi en reningsmetod baserat på pericentriolar materialet 1 (PCM-1). Tidigare har vi stärkt giltigheten av vår kärnor isolering genom att visa att tre oberoende nukleära markörer, PCM-1, kardiellt troponin T och I, identifiera samma kardiomyocetisk befolkningen. 2,3 Den renade befolkningen visade en hög anrikning av kardiomyocetisk specifika genprodukter som som hjärt troponiner, myosin tung kedja protein och transkriptionsfaktor Nkx2.5 och GATA4 2,3.
Det nuvarande protokollet, som bygger på PCM-1, har framgångsrikt tillämpats feller analys av human-och mus-kardiomyocyter omsättning 2,4 samt för analys av transkriptions kardiomyocyter profilen 2. Vi förväntar oss att den presenterade strategi kan också anpassas till isolering av kardiomyocyter från andra arter. PCM-1, en centrosomen protein, åter-lokaliseras till det nukleära membranet där det ackumuleras och bildar en olöslig matris endast i differentierade myocyter 2,14 (Fig. 1). Flödescytometri möjliggör snabb förspända analys av ett stort antal celler, som krävs för att kvantifiera sällsynta händelser i kardiomyocyter som celldöd och cellcykel återinträde 15. Vidare (t.ex. BrdU) nukleotidanaloger baserade proliferationsanalyser kan lätt anbringas med användning av vår teknik presenteras 4. Vår teknik har den fördelen att DNA-innehållet av en enda kardiomyocetisk kärnor (kärnkraft ploidi) kan analyseras i multinukleära kardiomyocyter 16,17, vilket ger viktig informationatt skilja mellan kardiomyocetisk dubbelarbete och polyploidisation 6-8. Men på grund av arten av vår strategi är en karakterisering av kardiomyocetisk multinukleering inte möjlig.
Ytterligare tillämpningar av den presenterade metoden är studier fokuserade på epigenetiska förändringar av kromatin, nukleoproteiner, protein-DNA/RNA interaktioner och i kärnkraftsfrågan transkriptom 18,19.
På grund av stabiliteten hos kärnorna i frys-tinat vävnad, kan den presenterade kärnorna isoleringen strategi också tillämpas på frysta vävnader, vilket gör det möjligt att använda arkiverat material från biobanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi gillar att erkänna Marcelo Toro för hjälp med flödescytometri. Denna studie stöddes av svenska Hjärt-och Lungfonden, EU-kommissionen FP7 "CardioCell", Svenska Vetenskapsrådet, AFA försäkringar och ALF. OB stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Lysis Buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Sucrose buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 2.1 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.44 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM spermine | |||
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam | ||
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences | ||
| Glass douncer (40 ml) and pestle "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany | ||
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR | ||
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter | ||
| Influx cytometer | Beckman Coulter | ||
| Tube Rotator | VWR |
References
- Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
- Bergmann, O. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).
- Bergmann, O. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans. Science. 324, 98-102 (1126).
- Walsh, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation. Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).
- Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts. Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).
- Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).
- Adler, C. P., Friedburg, H. Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age. Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).
- Dubois, N. C. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature. 29, 1011-1018 (2011).
- Hattori, F. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7, 61-66 (2010).
- Fransioli, J. Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium. Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).
- Elliott, D. A. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).
- Laflamme, M. A. Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts. Circulation Research. 90, 634-640 (2002).
- Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation. BMC cell biology. 10, 28 (2009).
- Spoelgen, R. A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain. Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).
- Olivetti, G. Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart. J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).
- Okada, S. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue. J. Vis. Exp. (20), e914 (2008).
