Summary
Kardiyak çekirdeklerin yoğunluğu sedimentasyon ile izole edilmiş ve akım sitometri kardiyomiyosit çekirdeklerinin belirlemek ve sıralamak için pericentriolar malzeme 1 (PCM-1) karşı antikorlar ile immunolabeled edilir.
Abstract
En stratejileri sadece sitoplazmik protein işaretleyicileri 1 güveniyor gibi kardiyomiyosit çekirdeklerinin belirlenmesi doku kesitlerinde zor olmuştur. Gibi çoğalması ve apoptosis gibi kardiyak miyositler Nadir olaylar kardiyak miyosit çekirdeklerinin doğru bir tanımlama homeostazında ve patolojik durumların 2 hücresel yenilenme analiz gerektirir. Burada, pericentriolar malzeme 1 (PCM-1) ve sonraki akım sitometri sıralama karşı antikorlar ile yoğunluğu sedimantasyon ve immün tarafından otopsi doku kardiyomiyosit çekirdekleri izole etmek için bir yöntem sağlar. Bu strateji, taze doku ve dondurulmuş arşiv malzemesi gayet iyi çalışma avantajı ile yüksek verimlilik analizi ve izolasyon sağlar. Bu da zaten biyobankalar toplanan malzeme çalışma kolaylaştırır. Bu teknik uygulanabilir ve türler, geniş bir aralık içinde test edilmiştir ve karbon-14 3, hücre-CY olarak birden çok alt-uygulamalar için uygundurcle analizi 4, timidin analogları görselleştirme (örneğin BrdU ve DUK) 4, transcriptome ve epigenetik analizi.
Protocol
1. Kardiyak Çekirdek İzolasyonu
- % 1 BSA / PBS kaplama solüsyonu 10 ml Coat ultrasantrifüjdeki tüpler (Beckman santrifüj tüpünde # 363.664). Tüpler Cap ve onları bir tüp rotator 30 dakika döndürün. Kaplama çözümü çıkarın ve santrifüj tüplerine hava kuru (fare kalp başına bir tüp farklı canlı türlerinin tek bir fare kalpleri, dönüşümlü olarak 5'e kadar fare kalpleri veya kalp dokusunun 1 gr analizi için gerekli izin (örneğin insan) işlenebilir bir tüp içinde).
- Bütün aşağıdaki adımları buz üzerinde yapılmalıdır. Bistüri ile taze veya ek donmuş fare kalpten sol ventrikül parçalara ayır. Not, bu protokol fare kalp için optimize edilmiş değil, aynı zamanda sıçan veya insan kalp adapte edilebilir. Alternatif olarak, farklı canlı türlerinin kalp dokusunun 1 g kadar kullanabilirsiniz.
- Bistüri ile küçük hücreler halinde numune kesin.
- Lizis tamponu ile 15 ml ile doldurulmuş bir 50 ml Falcon tüp içine doku parçaları transfer edin.
- Homojenize10 sn için 24,000 rpm bir T-25 Ultra-Turrax prob homojenizör (IKA) ile kalp dokusu.
- 30 ml lizis tamponu eşit hacmi Homojenat sulandırınız.
- Daha fazla doku ve serbest çekirdekler homojenize bir cam douncer (40 ml) kullanın. Büyük bir boşluk havaneli sekiz vuruş yapın.
- Ham çekirdek, 100 mikron ile 70 mikron naylon örgü hücre süzgecinden (BD Biosciences), ardışık yoluyla izole geçirin.
- Ham çekirdekler 10 dakika süreyle 700 xg'de bir soğutmalı santrifüj (4 ° C) izole aşağı Spin.
- Ters tüpler tarafından dikkatle Süpernatantı ve kağıt havluyla tüpün içini silin. Çekirdekler pelet rahatsız dikkat edin.
- Ham çekirdek çözümü birkaç kez pipetleme ve aşağı sakaroz tampon 5ml izole eritin. Çözünmüş pelet ile sükroz tampon, bir başka 25 ml ilave edilir.
- Kaplamalı ultrasantrifüjdeki tüp (adım 1.1) için taze hazırlanmış sakaroz tampon 10 ml ekleyin. </ Li>
- Dikkatli bir şekilde adım 1.9 den sükroz tampon içinde yeniden süspanse çözünmüş çekirdekler pelet ile sükroz tampon katma 10 ml kaplamak.
- Bir JS13.1 ücretsiz sallanan rotor koymadan önce santrifüj tüplerine dengelemek ve yüksek hızlı santrifüj (Beckman Avanti S-25) içine rotor yerleştirin.
- 60 dakika süre ile 4 ° C'de 13,000 x g'de çekirdekler Örnek dönerler.
- Spin tamamlandığında, rotor dikkatlice tüpleri çıkarın ve ters tüpleri ile süpernatantı atın ve kağıt havlu ile tüplerin içerisinden kalan enkaz silerek.
- Çekirdeklerin depolama tamponu (NSB artı tampon) 1 ml içinde çekirdekleri pelet eritin. Not: NSB artı bir DNA stabilizatörü olarak 1.5 mM spermin içerir.
- Kardiyomiyosit çekirdeklerinin İmmünoboyama, adım 2.1 ile devam edin.
2. Akım Sitometri için pozitif
- Immünboyama için negatif kontrol hazırlayın. Bir çekirdek numunenin 20 ul dışında tablet ve bir atınNSB artı tamponu dd 980 ul.
- Immunolabel kardiyomiyosit çekirdeklere 1:500 dilüsyon içinde çekirdek örnek anti-pericentriolar malzeme 1 antikoru (tavşan anti-PCM-1, Atlas Antikorlar) ekleyin. Adım 2,1 hazırlanan negatif kontrol etmek anti-PCM-1 antikoru ile aynı seyreltme, in izotip antikor ekleyin.
- 4 ° C'da negatif kontrol ve numune inkübe edin.
- NSB artı tamponu (10 dakika için 700 xg'de bir soğutmalı santrifüj (4 ° C) tüpler aşağı döndürün. Süpernatan atın ve NSB artı tampon 1 ml çekirdekleri pelet erimesi) ile en az bir kez negatif kontrol ve numune yıkayın.
- 1:1000 dilüsyon negatif kontrol ve numune tüpüne anti-tavşan floresan sekonder antikor (FITC veya APC) ekleyin.
- 1 saat boyunca 4 ° C de negatif kontrol ve numune inkübe.
- NSB artı tamponu (10 dakika için 700 xg'de bir soğutmalı santrifüj (4 ° C) tüpler aşağı spin ile en az bir kez negatif kontrol ve numune yıkayın. Süpernatant atın ve) NSB artı tampon 1 ml çekirdekleri pelet çözülür.
- Akım sitometri analizi ve sıralama ile devam edin.
3. Akım Sitometri
- Adım 1.1 'de tarif edildiği gibi sıralama akış sitometrisi başlamadan önce,% 1 BSA / PBS çözeltisi ile Coat çekirdekler toplama tüpleri (Falcon 15 ml).
- Örnek 30 um ve bir hücre süzgecinden negatif kontrol filtre ve (BD Akın) ilk akış sitometresi ile negatif kontrol yerleştirin. Forward scatter (FSC), forward scatter darbe genişliği (FS darbe genişliği) ve yan dağılım (SSC) (Şekil 2a ve b) dayalı, çekirdekler ve mayoları (tek çekirdek) tanımlamak için birinci ve ikinci kapısı tanımlayın. Örnek leke bir DNA (DRAQ5 (1:500)) ekleme başlangıçta çekirdek nüfusu belirlemek için yardımcı olabilir.
- Immunolabeled örnek yükleyin ve non-kardiyomiyosit çekirdek (PCM-1-negatif) gelen kardiyomiyosit çekirdeklerin (PCM-1-positve) izole etmek için üçüncü kapısı tanımlar. Sıralama başlayın(Şekil 2 c ve d).
İsteğe bağlı: nükleer DNA içeriği (ploidi) analiz etmek ve çekirdekleri (örn. Hoechst 33342 veya DRAQ5) (Şekil 2e) için leke uygun bir DNA eklemek hücre döngüsü analizi gerçekleştirmek için.
- Flow sitometri sıralama sonra, buz çekirdekleri yerleştirin ve sıralama saflık (Şekil 3a ve b) belirlemek için yeniden analiz.
- 15 dakika için soğutmalı santrifüj 1500 xg'de toplama tüpleri içinde sıralanır çekirdekleri aşağıya Spin.
- Aşağı uygulama ile uyumlu bir tampon içinde çekirdekler pelet içinde çözülür.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Çekirdek morfoloji ve DNA bütünlüğü lekeleri tarafından değerlendirilmeli ve mikroskobu (Şekil 1) ile görüntülenebilir. Başarılı PCM-1 etiketleme Epifloresans mikroskop ile ve akım sitometri (Şekil 1 ve Şekil. 2c ve d) tarafından değerlendirilebilir. PCM-1-positiettik ve negatif popülasyonunda (Şekil 2c ve d) birbirinden ayrılmalıdır. Fare sol ventrikül tüm çekirdeklerin yaklaşık% 30 (Şekil 2d) kardiyomiyosit çekirdeklerinin olmalıdır. Saflık Sıralama sıralanır çekirdeklerin (Şekil 3a ve b) yeniden analiz edilerek değerlendirilebilir. Her iki çekirdek popülasyonları% 95 aşan bir sıralama saflıkta olmalıdır.
Şekil 1.. PCM-1 kardiyomiyosit çekirdekler tanımlar. Kardiyak çekirdekler (a) PCM-1 (b) ve yetişkin bir fare kalbinde Nkx2.5 (c) antikorları ile boyanmış edilir. (D) PCM-1-etiketli çekirdekleri kardiyomiyosit sitoplazma (miyozin ağır zincir (MHC)) ile çevrilidir ve PCM-1 boyanmasının (ölçek çubukları 20 mikron ve 10 kardiyomiyosit çekirdeklerinin doğru kimlik belgeleyen, transkripsiyon faktörü Nkx2.5 ifade edilir mikron (d, inset)). (E) DNA ile görselleştirildiği Kardiyak çekirdekleri izole DRAQ5 leke. (F ve g) CardiomyocYTE çekirdekler PCM-1 (ölçek çubuğu 10 mikron) karşı antikorlar ile etiketlenir. Not, doku bölümünde miyosit çekirdek ve izole çekirdek (oklar), PCM-1 epinuclear boyanma paterni.
Şekil 2. Kardiyomiyosit çekirdeklerinin Akış sitometrik sıralama. (A) Kardiyak çekirdeklerin forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) ile tanımlanır. (B) ikinci bir kapısı FSC ve FS darbe genişliği 5 ile tek çekirdek tanımlar. (C, d) Fluorescent perdeleme kalp dokudan kardiyomiyosit çekirdeklerin ayrılması (PCM-1-pozitif) ve non-kardiyomiyosit (PCM-1-negatif) çekirdekler sağlar. (E) Fare kardiyomiyosit çoğunlukla (>% 80) diploit (2n) olan, sadece küçük bir alt kümesini (4n) 6 tetraploid olduğunu. Not, insan kardiyomiyositlerin poliploidi çekirdeğinin daha yüksek bir frekans (> 2n) 7,8 içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kardiyomiyosit çekirdeklerinin doğru tespit miyokard 2,3 rejeneratif süreçlerinin analizi için çok önemlidir. Taze dokudan kardiyomiyositler izole etmek için, geleneksel teknikler özellikle hücre dışı matris proteinlerine enzimatik sindirimi ve düşük hızlı santrifüjleme ile interstisyel hücreleri daha sonra saflaştırma dayanmaktadır. Embriyonik kök hücreler (ESC) ile yaşayan kardiyomiyositlerin saflaştırma gibi Sirpa 9 veya mitokondriyal boyalar 10 gibi yüzey işaretleri ile immün tarafından yapılabilir, sabit kardiyomiyositler gibi miyozin ağır zincir (MHC) veya gibi nükleer proteinler gibi sitoplazmik belirteçler tarafından tespit edilebilir GATA4 veya Nkx2.5. Bununla birlikte, Nkx2.5 ve GATA4 ifadesi olgun kardiyomiyositler ile sınırlı değildir, fakat, aynı zamanda gelişimi sırasında ve kalp enfarktüsü 11,12 sonra progenitör hücrelerde tespit edilebilir. Kardiyomiyositler tanımlamak için Genetik stratejileri en yüksek özgüllük, ancak c göstermekannot büyük bir hayvan modellerinde ve insan 1 'de uygulanabilir. Mevcut stratejilerin sınırlamalar, proliferasyon, apoptoz ve kimerizm 1,13 gibi nadir olaylar miktarının dayanarak tartışmalı sonuçlara yol açmıştır. Böylece, olgun farklılaştırılmış kardiyomiyosit çekirdeklerinin belirlemek ve arındırmak için doğru bir strateji oluşturmak için bir ihtiyaç vardır.
Burada, pericentriolar malzeme 1 (PCM-1) dayanan bir arıtma tekniği tanımlandı. Daha önce, üç bağımsız nükleer belirteçler, PCM-1, kardiyak Troponin T ve ben, aynı kardiyomiyosit nüfus tespit göstererek bizim çekirdek izolasyon geçerliliğini güçlendirdi. 2,3 saflaştırılmış nüfus kardiyomiyosit spesifik gen ürünlerinin yüksek zenginleştirme gösterdi gibi kardiyak troponinler, miyozin ağır zincir protein ve transkripsiyon faktörü Nkx2.5 ve GATA4 2,3 olarak.
PCM-1 bazında geçerli protokol, f başarıyla uygulanmıştırveya insan ve fare kardiyomiyosit devir 2,4 gibi kardiyomiyosit transkripsiyonel profili 2 analizi için analiz. Biz sunulan strateji de diğer türlerden kardiyomiyositlerin izolasyon adapte edilebilir tahmin ediyoruz. PCM-1, bir sentrozom proteini, bunun birikir nükleer membrana yeniden lokalize ve sadece farklılaşmış miyosit 2,14 (Şekil 1) in, çözülmeyen bir matris oluşturan. Akış sitometrisi örneğin apoptozis ve hücre döngüsü yeniden giriş 15 gibi olaylara kardiyomiyositler nadir ölçmek için gerekli olan hücrelerin sayısının yüksek hızla tarafsız analiz sağlar. Ayrıca, nükleotid analogları (örn. BrdU) tabanlı proliferasyon deneyleri da bizim sunulan tekniği 4 kullanılarak yapılabilir. Bizim tekniği tek kardiyomiyosit çekirdek (nükleer ploidi) DNA içeriği önemli bilgiler sağlar multinükleer kardiyomiyositler 16,17, analiz edilebilir bir avantajı vardırkardiyomiyosit çoğaltma ve polyploidisation 6-8 arasında ayrım. Ancak, stratejinin doğası gereği, kardiyomiyosit multinucleation bir karakterizasyon mümkün değildir.
Yöntemin ileri uygulamalar epigenetik kromatin değişiklikleri, nükleoproteinleri, protein-DNA/RNA etkileşimleri ve nükleer transcriptome 18,19 odaklı çalışmalardır.
Çünkü dondurma-çözülmüş dokuda çekirdeklerin stabilite, sunulan çekirdekler izolasyonu stratejisi, aynı zamanda biyobankalar arşivlerinizde malzemesi kullanmak için mümkün kılan, dondurulmuş doku uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz sitometrisi ile yardım için Marcelo Toro kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, İsveç ve Kalp-Akciğer Vakfı, AB Komisyonu 7.ÇP "CardioCell", İsveç Araştırma Konseyi, AFA sigortalar ve ALF tarafından desteklenmiştir. OB Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Lysis Buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Sucrose buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 2.1 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.44 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM spermine | |||
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam | ||
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences | ||
| Glass douncer (40 ml) and pestle "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany | ||
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR | ||
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter | ||
| Influx cytometer | Beckman Coulter | ||
| Tube Rotator | VWR |
References
- Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
- Bergmann, O. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).
- Bergmann, O. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans. Science. 324, 98-102 (1126).
- Walsh, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation. Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).
- Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts. Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).
- Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).
- Adler, C. P., Friedburg, H. Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age. Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).
- Dubois, N. C. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature. 29, 1011-1018 (2011).
- Hattori, F. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7, 61-66 (2010).
- Fransioli, J. Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium. Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).
- Elliott, D. A. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).
- Laflamme, M. A. Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts. Circulation Research. 90, 634-640 (2002).
- Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation. BMC cell biology. 10, 28 (2009).
- Spoelgen, R. A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain. Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).
- Olivetti, G. Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart. J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).
- Okada, S. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue. J. Vis. Exp. (20), e914 (2008).
