Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Summary

In questo protocollo, che aggiorniamo i recenti progressi nel campo dell'imaging Ca

Abstract

Nonostante un aumento enorme nella nostra conoscenza dei meccanismi alla base della codifica delle informazioni nel cervello, una questione centrale relativa alle tappe precise molecolari così come l'attività dei neuroni specifici nuclei multi-funzionale delle aree cerebrali come l'ipotalamo rimangono. Questo problema si include l'identificazione dei componenti molecolari coinvolti nella regolazione delle cascate di trasduzione del segnale diverse neuro ormone. Elevazioni di Ca ^{2 +} intracellulare svolgono un ruolo importante nella regolazione della sensibilità dei neuroni, sia a livello di trasduzione del segnale e nei siti sinaptici.

Sono emersi nuovi strumenti per identificare neuroni nel miriade di neuroni cerebrali esprimendo la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo di un promotore specifico. Per monitorare tempo e nello spazio stimolo-indotto di Ca ^{2 +} risposte in GFP-tagged neuroni, un non-verde fluorescente Ca ^{2 +} indicatore colorante nresponsabili politici da utilizzare. Inoltre, la microscopia confocale è un metodo preferito di neuroni immagini singole fette di tessuto a causa della sua capacità di visualizzare neuroni in diversi piani di profondità all'interno del tessuto e di limitare out-of-focus fluorescenza. Il raziometrico Ca ^{2 +} indicatore fura-2 è stato usato in combinazione con GFP-tagged neuroni ^1. Tuttavia, il colorante viene eccitato da raggi ultravioletti (UV). Il costo del laser e la limitata profondità di penetrazione della luce UV ottico ostacolato il suo uso in molti laboratori. Inoltre, fluorescenza GFP può interferire con le fura-2 segnali ^2. Pertanto, abbiamo deciso di utilizzare un rosso fluorescente Ca ^{2 +} indicatore colorante. L'enorme cambiamento Strokes di fura-rosso permette analisi multicolore della fluorescenza rossa in combinazione con GFP usando una singola lunghezza d'onda di eccitazione. Abbiamo avuto buoni risultati precedentemente con fura-rosso, in combinazione con GFP-tagged neuroni olfattivi ^3. I protocolli di fettine di tessuto olfattivi sembrava funzionare equally bene in neuroni ipotalamici ^4. Fura-rosso sulla base di Ca ^{2 +} di imaging è successo anche in combinazione con GFP-tagged pancreatiche β-cellule e GFP-tagged recettori espressi in cellule HEK ^5,6. Una peculiarità del piccolo fura-red è che la sua intensità di fluorescenza a 650 nm diminuisce per l'indicatore si lega calcio ^7. Pertanto, la fluorescenza di neuroni di sosta con bassa concentrazione di Ca ^{2 +} ha intensità relativamente elevata. Va notato, che gli altri rossi Ca ^{2 +} indicatori di coloranti esistono o sono in fase di sviluppo, che potrebbe dare risultati migliori o migliorate di neuroni e aree cerebrali.

Protocol

1. Preparazione della soluzione e gel di agarosio

1. Preparare la soluzione extracellulare secondo la tabella con acqua bidistillata. Il pH sarà ~ 7,3 dopo 10 min con aerazione carbogeno (95% O _2/5% CO _2), l'osmolarità 300 mOsm ^8. Se una osmolarità superiore è necessario, esso può essere regolato aggiungendo più glucosio (1 mM mOsm uguale a 1). La soluzione viene filtrata due volte usando un filtro a membrana 0,2 micron per eliminare particelle di polvere e possibili contaminazioni batteriche.

Nome del reagente	Abbreviazione	Mol. peso	Conc..	Azienda	Cat. N °
Cloruro di sodio	NaCl	58,44 g / mol	120 mM	VWR	27810
Di sodio idrogeno <carbonato/ Td>	NaHCO 3	84,01 g / mol	25 mM	Merck	106329
Cloruro di potassio	KCl	74,55 g / mol	5 mM	Merck	104936
BES *	C 6 H 15 NO 5 S	213,25 g / mol	5 mM	Sigma	14853
Magnesio solfato, anidro	MgSO4	120,37 g / mol	1 mM	Sigma	M7506
Cloruro di calcio diidrato	CaCl * 2H 2 O	147,02 g / mol	1 mM	Merck	102382
D (+)-glucosio monoidrato	C 6 H 12 O 8 * H 2 O	198,17 g / mol	10 mM	Merck	108342

*N, N-Bis (2-idrossietil)-2-acido aminoethansulfonic

2. La soluzione viene conservata a 4 ° C, ma deve essere aerato con carbogeno (95% O _2/5% CO ₂₎ per 10 minuti prima dell'uso.
3. In questo momento, preparare anche 1 cm ³ blocchi di gel di agar per stabilizzare il cervello durante la procedura di taglio (vedi punto 3). Primo, sciogliere 4% (w / v) agar (Sigma) in acqua bidistillata riscaldando la soluzione a circa 60 ° C. La soluzione riscaldata agar disciolto viene versata in una capsula Petri quadrato ad un'altezza di 1 cm. Dopo raffreddamento e indurimento, il gel di agar 4% viene tagliato in blocchi di 1 cm ^3. Questi blocchi possono essere conservati per un massimo di 4 settimane a 4 ° C.

2. Dissezione del cervello di topo

Assicurarsi che tutte le procedure sperimentali su animali sono eseguiti in conformità con le linee guida stabilite dai comitati al benessere degli animali delle rispettive istituzioni.

1. Prima Sacrificing l'animale, assicurarsi che i blocchi di agar gel sono pronti per l'uso.
2. Anestetizzare il mouse con isoflurano (1-4% isoflurano in ossigeno utilizzando un vaporizzatore di precisione per circa 1 min). È importante per evitare danni ipossia e quindi neuronale. Uno svantaggio di isoflurano è il costo e la logistica di utilizzare vaporizzatori precisione. Una overdose fatale in un sistema aperto, potrebbe essere un'alternativa, dal momento che il mouse saranno sacrificati. Sicurezza del lavoro in questo caso è un problema serio. L'isoflurano deve essere direttamente scaricata fuori dalla stanza. Pertanto, un sovradosaggio in un sistema aperto deve essere eseguita in una cappa.
3. Eutanasia il mouse per decapitazione dopo monitoraggio della profondità dell'anestesia testando il riflesso posteriore del piede. Questo pinch pedale o zampa riflesso viene eseguita da pizzicare saldamente una zampa o del piede tra le dita per provocare una risposta ritiro dell'animale. Un animale che mostra un riflesso non è a un livello di anestesia chirurgica e non certamenteuno stato di eutanasia.
4. Dopo la decapitazione, tagliare il cuoio capelluto con una lametta singolo bordo centrale in direzione sagittale, dall'osso frontale alla protuberanza occipitale esterna. Spostare le due parti del cuoio capelluto, prima della fine mediale caudale in rostrale direzione laterale, poi giù in direzione ventrale (Figura 1A-C).
5. Fare due laterali e un taglio rostrale nel foro occipitale con una forbice piccola molla (vedi per tagliare direzione delle frecce nere tratteggiate in Figura 1C). Fendere con cautela fuori dal cranio da mediocaudal a rostrale laterale con una pinza contundenti (vedi grandi frecce grigie nella Figura 1C). Nei vecchi animali un piccolo taglio alla sutura sagittale è utile e spesso necessario per evitare di danneggiare gli strati corticali del cervello.
6. In questo momento le ossa occipitale, parietale e interparietale deve essere staccato. Se persiste, la dura madre deve essere attentamente rimossi con pinze per evitare di danneggiare il brain nella fase successiva.
7. Togliete l'osso squamoso, il forame etmoidale anteriore e frontale (Figura 1D).
8. Il cervello può essere facilmente rimosse con una spatola rovesciata cucchiaio micro e recidere i nervi cranici (Figura 1E).

3. Affettare Sezioni coronali ipotalamica del cervello di topo

1. Posizionare il cervello sul suo lato ventrale su un taglio superficie resistente e rimuovere il cervelletto con singola lama di rasoio bordo (Figura 2A). Questa superficie taglio dritto sarà la base per il montaggio del cervello su una piastra per consentire di tagliare sezioni cerebrali coronali.
2. Incollare il cervello con la sezione di taglio sulla piastra di base del microtomo (Zeiss, Hyrax V50) usando piccole quantità di un veloce indurimento adesivo ad alta prestazioni colla cianoacrilato (Loctite 406; Figura 1A). Inoltre, colla di cm 1 ³ blocco gel di agar (vedere 1.5) sul lato ventrale del cervello (vedi 'v' in (Figura 2B).
3. Dopo alcuni secondi il legame si è asciugata, mettere il piatto nel bagno del microtomo pieno di 6 ° C a freddo ossigenata (95% O _2/5% di CO ₂₎ soluzione extracellulare (vedere 1.1).
4. Utilizzare adeguati bassa velocità affettare e tagliare fette 300 micron di spessore. Nel caso del nostro microtomo, usiamo una frequenza di 60 Hz, un'ampiezza di 0,8 mm ed una velocità di 0,8 mm / s (Figura 2C). Le fettine cerebrali coronali sono raccolti direttamente o dopo ogni taglio o può essere lasciato nel bagno fino a tutto il cervello è stato sezionato. Le fette coronali del cervello sono accuratamente transfecui fa riferimento il un bicchiere freddo con soluzione ossigenata extracellulare. Vari strumenti sono stati progettati per eseguire il trasferimento (ad esempio taglio di plastica o di vetro ampio pipette Pasteur o spatole cucchiaio di massima). Dipende dalla sperimentatore che viene preferito. La cosa più importante, le fette devono essere gestiti in modo adeguato per ridurre al minimo i danni.
5. Se il microtomo può essere programmato per tagliare fette automaticamente, si può iniziare a preparare il Ca ^{2 +} soluzione colorante indicatore di carico in questo momento. Altrimenti, si raccomanda che la preparazione di questa soluzione viene eseguita prima che il cervello affettamento ha finito per ridurre i ritardi per misurare risposte Ca ^{2 +} nei neuroni, cioè prima di iniziare la fase 2.

4. Preparazione della Soluzione ² Indicatore di Ca ⁺ Loading Dye

Un punto critico in neuroni carico rimane spesso la salute delle cellule, che dipende dalla quantità di danno indotto da e la velocità dila procedura di dissezione. Un altro passo fondamentale sembra essere l'uso di Pluronic fresco F-127 soluzione (vedere 4.1). Viene consigliato di fare questa soluzione in laboratorio e non utilizzare una soluzione premade da un fornitore. A seconda della temperatura, l'umidità e la durata di conservazione del Pluronic F-127 soluzione, abbiamo notato degradazione dei neuroni olfattivi e cervello durante il Ca ^{2 +} procedura di caricamento.

1. Preparare il 20% (w / v) Pluronic F-127 (Sigma) in dimetilsolfossido (DMSO) aggiungendo la Pluronic F-127 polvere sulla superficie della soluzione DMSO. Direttamente da sonicazione questa soluzione senza vortice preventiva o di miscelazione. Entro 2 minuti, la sonicazione Pluronic F-127 sarà sciolta. 100 microlitri Pluronic F-127 soluzioni vengono preparate fresche settimanale.
2. Prendete un tubo di 50 mg cellula permeabile fura-red/AM (Invitrogen, AM, acetossimetil estere) e aggiungere 5 Pluronic pl 20% F-127 soluzione. Mescolare la soluzione con la punta della pipetta.
3. Aggiungere 45 microlitri soluzione molto extracellulare(vedere 1.1) per il mix e vortice è breve.
4. Aggiungi un ulteriore 325 ul di soluzione extracellulare e sonicare il tubo per 3 min.
5. Dopo sonicazione aggiungere 1,156 ml ossigenata (95% O _2/5% di CO ₂₎ soluzione extracellulare per ottenere il finale Ca ^{2 +} indicatore di soluzione colorante di caricamento (30 fura-red/AM mM, 0,33% DMSO e 0,065% Pluronic F-127) . Conservare il tubo in un luogo oscuro, finché l'uso (vedere paragrafo 4.8).
6. Trasferire le fettine cerebrali coronali ad un piastra da 6 pozzetti di coltura cellulare (BD Falcon) riempito con ossigenata (95% O _2/5% CO ₂₎ soluzione extracellulare (fino a sei fette per pozzetto).
7. Aspirare la soluzione ossigenata extracellulare dalle camere della piastra da 6 pozzetti facendo attenzione a non danneggiare le fettine di cervello.
8. Pipettare direttamente 750 microlitri della soluzione di Ca ² Indicatore di carico ⁺ colorante per ogni bene. Le fettine di cervello dovrebbero essere coperti dalla soluzione contenente fura-red/AM (carico immersione).
9. Incubatposta le fette in un O ₂ / CO ₂ incubatore per colture cellulari (O _2: 23,5%; CO _2: 5%) per 45 a 60 min a 37 ° C.
10. Alla fine del periodo di incubazione, sostituire il Ca ^{2 +} soluzione colorante indicatore loading dalla soluzione fresca ossigenata extracellulare per evitare di sovraccaricare le cellule con fura-rosso e influenzare in modo sottile il Ca ^{2 +} misurazione tramite l'azione chelante del colorante. Le fette vengono poi tenuti in O ₂ / CO ₂ incubatore (vedi punto precedente per le impostazioni), fino al momento dell'uso e sono vitali per un massimo di 3-6 ore.

5. Microscopia e analisi

In questo protocollo, l'intensità di fluorescenza di GFP, che identifica la cella di interesse e del Ca ^{2 +} colorante indicatore saranno misurati simultaneamente in fettine cerebrali. Così, il microscopio confocale deve essere equipaggiato con il laser corretta, filtri e due tubi fotomoltiplicatori per raccogliere i due emissisu segnali. GFP e la variazione di intensità di fluorescenza di fura-rosso può essere misurata usando una singola lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm. Fluorescenza di emissione dai fluorofori possono essere raccolti utilizzando un 522/DF35 nm filtro per GFP e una lunga filtro passa-per lunghezze d'onda superiori a 600 nm per il fura-rosso.

1. Per avviare il monitoraggio di stimolo-indotte nel segnale di fluorescenza, che sono una misura della concentrazione intracellulare di Ca ^{2 +,} uno dei fura-rosso fettine di cervello caricati verrà trasferito in una camera di registrazione (ad esempio Warner Instruments RC-27 Sezione Open Bath) che può essere montato sulla configurazione microscopio confocale (Figura 3A, B).
2. Fissare la fetta cervello con un arpa (Figura 3C) per evitare che la fetta di muoversi a causa della velocità di perfusione della soluzione del bagno (ossigenata soluzione extracellulare, vedi passo 1.1). L'arpa (titolare slice) è realizzato in un array parallelo di fili di nylon (separate l'una dall'altra da ~ 1 mm) infilate suun argento forma di U o telaio platino. La temperatura della soluzione del bagno a questo punto dovrebbe essere almeno di temperatura ambiente. Se sono necessarie temperature più elevate, le cure adeguate deve essere presa per evitare la condensa sulle lenti del microscopio e il movimento del piano di messa a fuoco a causa di spostamento di componenti del microscopio.
3. Perfusione la fetta per 10 minuti con una soluzione ossigenata extracellulare per rimuovere qualsiasi eccesso di extracellulare Ca ^{2 +} indicatore colorante. La portata della perfusione deve essere regolata per ~ 100 (suggerimenti per quanto riguarda un sistema di perfusione adeguata vedi ⁹⁾ pl / s.
4. Guarda la fetta attraverso il microscopio a basso ingrandimento, prendere nota dell'orientamento della fetta per il proprio archivio e trovare l'area di interesse nella fetta, nel nostro caso l'area ipotalamica del cervello.
5. Cambiare ingrandimento e trovare la cella di interesse nella fetta raccogliendo immagini GFP e contemporaneamente controllare l'intensità di fluorescenza della fura-rossosegnale (Figure 4A-C). Le cellule vicino alla superficie potrebbe essere danneggiato o morto. Pertanto, cellule situate ad una profondità superiore a 10 um dovrebbe essere selezionato per l'imaging. Potremmo attendibilmente valutare cellule fino ad una profondità di 40-50 micron, dopodiché il segnale iniziato a calare. Ricordate che il fura-rosso segnale delle cellule a riposo con una bassa concentrazione di Ca ^{2 +} sono relativamente alte intensità di fluorescenza. Questa alta intensità di fluorescenza è in questo caso non è un segno di cellule morte. Il segnale GFP può essere utilizzato per rilevare qualsiasi deriva o movimento della fetta tessuto o come indicatore per le variazioni di pH intracellulare ^10.
6. Regolare la potenza del laser ad un valore che consente misurazioni del cambiamento di fura-rosso intensità di fluorescenza e impedisce sbiancamento dei due fluorofori. Quindi, iniziare con la minore potenza del laser e regolare per ottenere un sufficiente rapporto segnale-rumore cambiando il livello del nero (offset), l'apertura del rivelatore, il guadagno e filtro a densità neutra lasers. Fatta eccezione per la potenza del laser, lo stesso dovrebbe essere fatto per il segnale GFP.
7. Avvio di acquisire immagini a prezzi tra 0,5 - 2 Hz per raccogliere il fura-rosso e segnali GFP. La rata di acquisizione dovrebbe essere ottimizzato per il tasso atteso del Ca ^{2 +} segnale. Voltaggio-dipendenti del Ca ^{2 +} può causare picchi transitori più rapidi e più brevi di attivazione di cascate di trasduzione del segnale di alcuni che richiedono l'attivazione di vari secondi messaggeri. La lunghezza dell'acquisizione dell'immagine deve essere adeguato allo scopo dell'esperimento. Il segnale GFP nel tempo sarà possibile stabilire se ogni movimento della fetta cervello è verificato.
8. Durante l'acquisizione e l'esperimento, tutte le impostazioni di testa di scansione deve essere mantenuta costante per registrare risultati attendibili che possono essere comparati.
9. Le variazioni nella fluorescenza nel tempo possono essere analizzati utilizzando diversi programmi matematici, cioè ImageJ (NIH, Bethesda, MD; http:/ / Rsb.info.nih.gov / IJ /), Igor Pro (Wavemetrics) o Matlab (The MathWorks). Circondando la somata di una GFP-etichettato neurone indica la regione di interesse (ROI), questa regione esattamente lo stesso può essere analizzata per variazioni Ca ^{2 +} utilizzando il fura-rosso segnale di fluorescenza nel tempo.

Ca ^{2 +} segnali possono essere presentate come unità arbitrarie fluorescenza o come valori (Af / F) della variazione relativa intensità di fluorescenza (Af) normalizzati alla fluorescenza di linea di base (F). Questo procedimento in una deflessione negativa quando i intracellulari Ca ^{2 +} aumenta la concentrazione con fura-rosso come indicatore ² Ca ⁺ colorante. Per facilitare l'interpretazione dei risultati, si consiglia di moltiplicare le Af / F valori con -1 per ottenere positivi segnali di fluorescenza per visualizzare un aumento del Ca ^{2 +} (Figura 4C).

Per confrontare i risultati tra i neuroni l'ampiezza e la frequenza della Ca + Ca ² non si verificano con un periodo normale o ampiezze comparabili. Alcuni segnali possono essere fortemente influenzate dai processi stocastici all'interno della cellula. Così, per quantificare la variazione totale di Ca ^{2 +} in una determinata casella e per consentire un confronto di Ca ^{2 +} risposte tra neuroni in differenti regioni del cervello, l'analisi della area sotto la curva (AUC) è più appropriato. Questa misura per la quantità di Ca ^{2 +} comprende qualsiasi iniziale Ca ^{2 +} transitori, seconde fasi e sostenuto elevati Ca ^{2 +} risposte e oscillazioni. In questo caso la cura deve essere presa per analizzare lo stesso periodo di tempo per consentire il confronto tra i neuroni.

6. Risultati rappresentativi

Per avviare la caratterizzazione del recettore dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRHR) che esprime i neuroni nell'ipotalamo abbiamo fatto uso di topi transgenici che esprimono GFP dopo Cre-mediata escissionesione in GnRHR esprimenti neuroni ^4,11. GFP neuroni fluorescenti sono stati identificati in varie aree cerebrali, tra l'ipotalamo. Per studiare le proprietà fisiologiche di questi neuroni GnRHR, per prima cosa registrato Ca ^{2 +} segnali in fette ipotalamici utilizzando un microscopio confocale. Prima, abbiamo ottenuto fettine cerebrali coronali da questi topi usando il protocollo descritto sopra. Figura 1 illustra la necessaria strumenti, materiale e passaggi per asportare un cervello di topo. Le fette coronali del cervello ipotalamici sono stati tagliati (Figura 2) e poi caricato in base alla procedura di cui al punto 4 del protocollo. Fetta cervello unico dell'area appropriate sono posti in una camera di registrazione, fissato con un arpa (Figura 3) e poi ripreso con un microscopio confocale (vedi fasi 5,1-5,9). Figura 4 mostra un esempio di due singole sezioni coronali di cervello di identificazione unico GnRHR-τGFP corpi cellulari, la fluorescenza a riposo dopo loading la fetta cervello con fura-red/AM e l'immagine unita confocale indicando che il neurone GFP aveva preso fura-rosso sufficientemente per consentire indagini di stimolo indotto Ca ^{2 +} segnali in queste cellule. Usando il nostro protocollo abbiamo testato se inizialmente neuroni GnRHR utilizzare simili Ca ^{2 +} segnali per la rilevazione stimolo in diverse zone dell'ipotalamo in risposta all'attivazione diretta con GnRH (figura 4E). Tuttavia, questi segnali hanno diversamente waveform seconda forza stimolo e la zona ⁴ del cervello. Per quantificare la variazione dinamica delle risposte Ca ^{2 +,} l'area sotto la curva (AUC) può essere calcolata come misura per l'aumento intracellulare di Ca ^{2 +} (Figura 4E) ^4. Gli studi sono attualmente in corso per indagare le basi molecolari alla base delle ² onde ⁺ Ca e oscillazioni, la loro dipendenza da sesso e lo stato ormonale dell'animale, e se possono essere modulatada altri stimoli naturali.

Figura 1. Strumenti, materiali e le operazioni necessarie per l'escissione di un cervello di topo. A. Strumenti e materiali utilizzati per la dissezione del cervello: 1, Loctite 406 supercolla, 2, spatola, cucchiaio, micro, 3, lama ad archetto, 4, forbici a molla piccole e medie imprese, 5, pinze contundenti, 6, 7, forbici, capsula di Petri contenente agar gel di blocco, 8, piastra di base per il cervello il montaggio in microtomo. BF. Immagini di alcuni passaggi che vengono descritti al punto 2 del protocollo. Fotografia B. di una testa del mouse che indica la posizione di taglio del cuoio capelluto (linea rossa) e le frecce (arancione) che indicano la direzione della pelle deve essere tirato e rimosso dalle ossa (vedi punto 2.4). Fotografia C. della testa del mouse dopo che la pelle è tirata via che mostra le strutture ossee (vedi passo 2.4). Direzione di taglio a forbice e la direzione per rompere aperto il cranio con la pinza smussati è indicato sia con il nerotratteggiato frecce o grigio frecce larghe, rispettivamente. Fotografia D. del cervello di topo dopo aver eliminato le strutture ossee varie (vedi passo 2,5-2,7). Fotografia E. della rimozione del cervello ancora collegato al cranio tramite i nervi cranici. Fotografia F. di un cervello di topo relativamente intatto.

Figura 2. Affettare di sezioni coronali ipotalamica del cervello di topo. A. Fotografare indicante la posizione della singola lama di rasoio bordo per eliminare il cervelletto (vedi passo 3.1). B. Posizione del blocco gel di agar in relazione al cervello incollato sulla piastra di base del microtomo (v. punto 3.2). C. Taglio della fetta cervello coronale (notare la posizione del cervello e le posizioni di blocco di gel per quanto riguarda la lama di taglio del microtomo, vedere il punto 3.4.). d, dorsale, v, ventrale.

Figura 4. Ca ^{2 +} segnali in neuroni di topo τGFP fettine di cervello ipotalamico. AD. Identificazione di un neurone GFP e acquisizione simultanea del fura-fluorescenza rossa in fettine coronali di cervello di topo. A. immagine confocale di una fetta cervello coronale identificare GnRHR-τGFP neuroni (verde). B. relativamente uniforme del segnale di fluorescenza (rosso) della zona del cervello mostrato in A osservato dopo aver caricato la fetta cervello con fura-red/AM. C. Fusione immagine mostra la neuRons raffigurato in A caricato con il Ca ^{2 +} indicatore colorante (giallo). I confini di GFP neurone somata sono indicati in linee bianche tratteggiate, mentre esempi di due non-GFP somata (frecce) sono indicate nelle linee grigie. D. Esempio di GFP e non-GFP neurone con una maggiore quantità di fluorescenza rossa rispetto allo sfondo. E. Esempi di stimolo somatico-indotta Ca ^{2 +} risposte da singoli GFP-tagged neuroni in diverse aree cerebrali ipotalamici (Pe, periventricolare nucleo; DM, ipotalamo dorsomediale, Arco, nucleo arcuato). Area-sotto-la-curva (AUC) è rappresentata dalla zona rossa. La distinta Ca ^{2 +} segnali tra i neuroni che esprimono GnRHR provenienti da diversi nuclei ipotalamici possono essere confrontati con l'AUC come stima per la variazione totale di Ca ^{2 +} in una determinata casella durante lo stesso periodo. F. disegni schematici e diagrammi che indicano la posizione dei neuroni GFP-tagged analizzati in AE pannello superiore.: La sede di un s cervello coronaleezione contenente regioni cerebrali ipotalamici (linea rossa) Medio e pannello inferiore:. Disegno schematico di una fetta del cervello (al centro) e l'ingrandimento della sua zona rossa in scatola (pannello inferiore) indicando con puntini rossi la posizione approssimativa dei neuroni registrati GFP-tagged da il Pe, DM e Arc mostrato in E, nero zona nello schema pannello inferiore: 3 ^° ventricolo. Minori diagrammi due sono adattato da Paxinos e Franklin ^12. Basso numero a sinistra indica la distanza (mm) dal bregma.

Discussion

Una questione importante nel campo delle neuroscienze è quello di capire come il cervello elabora le informazioni sociale. La fonte principale delle informazioni necessarie per il riconoscimento sociale è codificato da segnali olfattivi o feromonale. La rilevazione di questi segnali da parte delle popolazioni neuronali nel naso e il riconoscimento dei segnali nel cervello, in particolare l'ipotalamo, svolgono un ruolo fondamentale in molti processi sociali ed ormoni influenza e di altri fattori neuroendocrini ^13-16. Un ostacolo fondamentale di analizzare le risposte neuronali in aree cerebrali come l'ipotalamo che contiene nuclei multifunzionale con neuroni più è l'identificazione dei neuroni specifici di interesse.

Molte linee di topi transgenici sono stati sviluppati, in cui principalmente GFP aiuta a identificare i neuroni. Purtroppo, la proprietà di fluorescenza di GFP complica la misurazione in Ca ^{2 +} coloranti indicatori quali fluo-3 e fluo-4 ^17. Abbiamo quindi cominciato a dell'inchiestacancello GFP-tagged neuroni con un rosso-spostato Ca ^{2 +} colorante indicatore, come il fura-rosso ^3,4. Fura-rosso basato Ca ^{2 +} imaging è stato precedentemente combinato con GFP-tagged pancreatiche β-cellule e GFP-etichetta recettori espressi in cellule HEK ^5,6. Come fura-2, alcuni diafonia tra fura-rosso e GFP è stato riportato ^2. Eppure, utilizzando alta qualità set di filtri di emissione con larghezze di banda fisse e filtri beamsplitter dichromatic può limitare il crosstalk / sfiato tramite tra i coloranti in una certa misura. È saggio per confermare le impostazioni di un microscopio confocale misurando entrambi i canali (fluorescenza verde e rosso) contemporaneamente usando (1) fette di cervello con neuroni GFP-etichetta, ma non caricata con il Ca ^{2 +} indicatore colorante, nonché come (2) fettine di cervello senza GFP-tagged neuroni, ma caricato con il rosso-spostato Ca ^{2 +} indicatore. Utilizzando le stesse impostazioni sul microscopio confocale come con un normale esperimento, il ricercatore può quindi notare se uny fluorescenza viene rilevata nel canale disparate, che deve essere evitata.

Alcuni ricercatori utilizzano Rhod-2 o raccomandare l'uso di X-rhod1 come alternativa colorante rosso-spostato in combinazione con le cellule GFP-tagged ^2,18,19. Tuttavia, rhod AM coloranti sembrano avere la tendenza a concentrare in mitocondri e ²⁰ hanno in molti neuroni bassa efficienza etichettatura ^17. A causa della necessità di migliorare la red-shift di Ca ^{2 +-indicatori,} ricercatori e le aziende stanno attualmente sviluppando nuove sonde con prestazioni superiori si spera ^21.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9770170
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9920120
O2/CO2 Incubator, CB210-UL	Binder	0019389
Super glue, Loctite 406TM	Henckel	142580
Double spatulas, spoon shape	Bochem	3182
Microspoon spatulas, spoon shape	Bochem	3344
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff - 7mm Blades	Fine Science Tools	15370-52
Spring Scissors, Vannas - 3mm Blades	Fine Science Tools	15000-00
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14071-12
Medical Forceps, Dumont 7b	Fine Science Tools	11270-20
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27)	Warner Instruments	64-0238
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100	Zeiss	n.a.