Mänskliga neuroendokrin tumör cellinjer som en tredimensionell modell för studiet av mänskliga neuroendokrin tumör Therapy

Summary

Vi presenterar en enkel agarosöverskikt plattform för att växa 3D flercelliga sfäroider med neuroendokrina cancercellinjer. Denna metod ger ett mycket bekvämt sätt för att undersöka effekten av terapeutiska läkemedel på de neuroendokrina tumörceller. Det kan också hjälpa oss att etablera humana neuroendokrina tumör sfäroiderna för cancerbehandling.

Abstract

Neuroendokrina tumörer (NET) är sällsynta tumörer, med en incidens av två per 100 000 personer per år, och står för 0,5% av alla mänskliga tumörer. ¹ Övriga än kirurgi för den minoritet av patienter som uppvisar lokaliserad sjukdom finns liten eller ingen överlevnadsfördel av systemisk terapi. Därför finns det ett stort behov av att bättre förstå biologi NET, och i synnerhet definiera nya terapeutiska mål för patienter med nonresectable eller metastaserande neuroendokrina tumörer. 3D cellodling har blivit en populär metod för läkemedels-screening på grund av dess relevans i modellera in vivo tumörvävnad organisation och mikromiljö. ^2,3 3D flercelliga sfäroiderna kan ge värdefull information på ett mer tid och billigare sätt än direkt gå från 2D cellodling experiment för att djur (mus) modeller.

För att underlätta upptäckten av nya terapeutiska medel för NET patients har vi utvecklat en in vitro 3D flercelliga sfäroider modell med de mänskliga NET cellinjer. De NET celler stryks ut i en icke-adhesiv agaros-belagda 24-brunnars platta och inkuberades under fysiologiska betingelser _(5% CO2, 37 ° C) med en mycket långsam omrörning under 16-24 h efter utstrykning. Cellerna bildar flercelliga sfäroiderna början på 3: ^e eller ^{4: e} dag. Sfäroiderna bli mer sfärisk av ^{6: e} dagen, vid vilken punkt läkemedelsbehandlingar initieras. Effekten av läkemedlet behandlingarna på NET sfäroiderna övervakas baserat på morfologi, storlek och form av sfäroiderna med en fas-kontrast ljusmikroskop. Storleken på sfäroiderna uppskattas automatiskt med hjälp av en anpassad utvecklat MATLAB program baserat på en aktiv kontur algoritm. Vidare visar vi en enkel metod för att bearbeta HistoGel inbäddning på dessa 3D sfäroiderna, medger användning av standard histologiska och immunhistokemiska tekniker.

Protocol

1. Framställning av 1% agaros-belagda 24-brunnars platta

1. Tillsätt 1 g agaros (RPI, A20090-500) till 100 ml avjoniserat vatten i en 250-500 ml-flaska och autoklav för sterilisering av agaros (121 ° C, 15 psi, 15 min i en autoklav maskin). Överföra flaskan med steriliserat agaros i en 70 ° C vattenbad. Agarosen är redo att hällas när den är kyld till 70 ° C, vilket tar ca en timme. Se till att hålla agarosen sterila hela tiden.
2. Få 24-såväl flatbottnade plattor (Falcon, 353.047), någon form av 24-brunnars flatbottnade plattor skulle fungera om plattorna kan avbildas i ett faskontrastmikroskop.
3. Tillsätt 200 pl av agaros till varje brunn med en Eppendorf repeater pipett i en biosäkerhet skåp och snurra agarosen runt brunnen för att göra det täcka väl jämnt. 200 pl av agaros är lämpligt för att bilda en konkav yta, så att sfäroiderna kan bilda de enhetliga sfäriska former. Mindre än 200 ^ agaros får intetäcker brunnen helt, men mer än 200 ^ agaros får inte bilda den konkava ytan och sfäroiderna som odlas på det kan inte bilda sfäriska former.
4. De agaros-belagda 24-brunnsplattor är redo att användas i ca 10 min. (Valfritt) Tillsätt 100 | il medium för att jämvikta agaros med odlingsmedium före sådd celler.
5. Alternativt, efter det agaros helt stelnade, tillsätt 100 | il tillväxtmedium till varje brunn och försegla plattorna med den sterila förseglingstejpen (Nunc, 236.366). Dessa plattor kan lagras vid 4 ° C under upp till en vecka.

2. Framställning av suspensioner av enskilda celler

1. Alla försöken utfördes med användning av aseptisk teknik i ett skåp biosäkerhet och alla kulturer odlas i ett 37 ° C fuktad inkubator med 5% _CO2 i luft om inte annat anges.
2. Human pankreas NET Bon-1-celler upprätthölls i DMEM/F12 (Invitrogen, 10.565) med 10% fetalt bovint serum (FBS, Invitrogen,16000-044)-medium i en 100 mm x 20 mm steril odlingsskål (Corning, 430.167).
3. När monolager Bon-1-celler nå 70-80% konfluens, avlägsnas mediet. Cellerna tvättas med PBS två gånger, och rubbas från skålen genom tillsats av 1 ml TrypLE (Invitrogen, 12.604) med 5 minuters inkubation vid 37 ° C. TrypLE liknar trypsin men är stabilt vid 15 - 30 ° C samt vid 4 ° C. Kolla under mikroskop för att se till att alla celler bort från skålen.
4. Tillsätt 9 mediet ml tillväxtmedium till de trypsiniserade cellerna och använda en pipett för att pipettera celler upp och ned några gånger för att säkerställa en jämn suspension av enstaka celler.
5. Använd 70-m cellfilter (Fisher, 22.363.548) för att filtrera cellerna.
6. Samla upp celler och utför en cellräkning med användning av guava PCA-96 Base System (Millipore).
7. Framställa en suspension av 5000 celler per ml i fenol-fri DMEM/F12 med 10% FBS tillväxtmedium.

3. Sfäroid kultur

1. Overlay 200 ul av den inrecellsuspensioner till agaros-belagda 24-brunnars platta och försegla 24-brunnsplattor med den sterila förseglingstejpen att förhindra avdunstning.

Anm: - Antalet celler som ska pläteras bör bestämmas empiriskt baserat på storleken av de sfäroider vid dag 6, 300-400 | im diameter av sfäroiderna skulle vara idealisk storlek för start av läkemedelsbehandling; 1000 BON-1 och H727 celler stryks.

- Vi rekommenderar inte börjar läkemedelsbehandlingar efter dag 6 på grund av att lönsamheten av 3D-cellerna börjar falla vid ungefär dag 10 (data visas ej, manuskript under utarbetande).

2. Placera de ovan nämnda agaros-belagda 24-brunnsplattor med BON-1-celler på en orbitalskakare vid en mycket långsam omröring av mindre än 40 varv per minut över natten i en 37 ° C fuktad inkubator med 5% _CO2 i luft. Flytta sedan dessa plattor till en stabil plattform att hålla kulturerna växa.
3. Tillsätt 200 pl odlingsmedium till varje brunn i plattan ovans var 3 dag. Stör inte de sfäroider. Försök att lägga till mediet genom väggen av varje brunn genom att röra pipettspetsen till sidan av brunnen och låta mediet strömma ned i brunnen.
4. Övervaka sfäroid-bildning i de 24-brunnsplattor under ett mikroskop.

4. Läkemedelsbehandling

1. När sfäroiderna nå omkring 300-400 nm i diameter vid dag 6, är 3D-sfäroiderna behandlas med läkemedel. Detta betecknas som dag 0 för läkemedelsbehandling.
2. Vid dag 6, innehåller varje brunn i plattan kring 400 | il medium. För att vara säker att läkemedelsbehandlingar är på 1x slutlig koncentration i varje brunn, 3x seriella spädningar av varje dos av behandlingar görs från drogen lager i 5 ml odlingsmedium i ett 15 ml koniskt rör, vilket räcker för 8 replikat.
3. Sfäroiderna vid varje rad av 24-brunnsplattan kategoriseras som vehikel, dos 1, 2, 3, 4 och 5. Det finns 4 replikat för varje dos av behandlingar på en 24-brunnsplatta (se
4. Centrifugera ner i 24-brunnars platta vid 800 rpm under 5 min vid 4 ° C för att försäkra att alla kondensationer på förseglingstejpen gå in i brunnen. På grund av den flytande funktionen av de 3D-sfäroider, mediet i varje brunn avlägsnas inte att undvika störning av de sfäroider.
5. Tillsätt försiktigt 200 pl av de ovan tillverkade behandlingar av varje dos i lämpliga brunnar längs väggen av varje brunn.
6. Täta de 24-brunnsplattor med förseglingstejp och inkubera de kulturer i 37 ° C fuktad inkubator med 5% _CO2 i luft.
7. Om så är nödvändigt, reträtt sfäroiderna vid varje brunn med respektive dos av behandlingar efter 72-96 timmar.

5. Monitor 3D sfäroid Kulturer

1. Vid varje vald tidpunkt efter läkemedelsbehandling (0, 24, 48, 72 h), sfäroiderna vid varje brunn i tHan 24-brunnar avbildas med en Zeiss Axiovert 200/M-based faskontrastmikroskop med en 5x mål.

Obs: Bilder kan tas vid ljusmikroskop med en kalibrerad skala mellan xm och pixel. En 5x mål är idealisk då sfäroiderna snabbt växa ur avbildning fält med en 10x mål.

2. Sfäroid analys kan göras manuellt med Zeiss AxioVision 4.8.2 programvara med RAW-bilder.
3. Alternativt en anpassad utvecklat MATLAB program som används för att uppskatta storleken på sfäroiderna automatiskt / semi-automatiskt. Det automatiska programmet genomförs den aktiva konturen algoritmen ⁴ att exakt lokalisera konturen av sfäroiden i en given bild och mäta dess viktigaste (L) och mindre (W) axlar automatiskt. En halvautomatisk version av samma algoritm tillåter användare att hjälpa till att initiera programmet när starka artefakt är närvarande. Alla bilder måste exporteras som TIFF eller JPEG-filformat frånde råa bilderna som ska läsas av programmet. Volymen av sfäroiden uppskattas 0,5 x L x W ^2.

6. HistoGel-inbäddning av Net 3D Sfäroider

1. 10-24 sfäroider som samlats in från 24-brunnars plattor, tvättades i PBS två gånger, fixerades i 10% formalin under 2 timmar, tvättades i 50% och 70% etanol under 15 min två gånger, respektive, och är redo för HistoGel inbäddning. Alternativt kan de hållas i 70% etanol vid 4 ° C under flera månader.
2. Ett rör av kall HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) placeras i en bägare fylld med vatten. Bägaren uppvärmdes i en mikrovågsugn under 1 min eller tills gelén fullständigt kondenseras sedan bibehålls i samma vatten-fyllda bägaren vid alla tidpunkter.
3. Sfäroiderna i 70% etanol från ovan överfördes till en biopsi cryomolden (Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565) med användning av en tandpetare. Se till att alla sfäroiderna överförs. Låt sfäroiderna sitta i en minut för att sjunka ned till botten av den biologiskapsy cryomolden. Försök att bli av med vätskorna i biopsin cryomolden med Kimwipes och under tiden, mycket försiktigt trycka sfäroiderna till mitten längst ned på biopsin cryomolden med engångsplast pasteurpipett. Detta steg kan vara lättare att göras under ett dissektionsmikroskop.
4. Ett tunt skikt av värmd HistoGel sättes till biopsi cryomolden att stabilisera sfäroiderna vid botten av biopsi cryomolden; Samtidigt är den tandpetare användas för att hålla sfäroiderna vid centrum vid botten av biopsianordningen cryomolden mycket försiktigt. Tillsätt inte alltför mycket HistoGel men precis tillräckligt för att stabilisera sfäroiderna vid botten av biopsianordningen cryomolden.
5. Låt sfäroiderna / HistoGel sitta under 1-2 min vid rumstemperatur eller tills HistoGel stelnar. Sedan fylla återstoden av biopsi cryomolden med den värmda HistoGel.
6. Tillåter den att stelna vid rumstemperatur under ca 10 min.
7. Strax före poppar ut sfäroiderna / HistoGel kvarter från biopsin cryomolden, Leave den vid 4 ° C under 1 min, vilket hjälper till poppar ut de intakta sfäroiderna / HistoGel block. Sfäroiderna / HistoGel blocket sedan insvept i en bit av Bio-wraps (Surgipath, 01.090) och placerades i en vävnad och biopsi kassett (Fisher Scientific, 15-182-701D). Vävnaden och biopsi kassetten lagras i en behållare med 70% etanol. Då rutinmässiga vävnadsbehandling förfaranden för paraffininbäddning följs. ⁵
8. Paraffinet blocket kan vara skuret i 3-im tjockt skikt glider. Glasen kan färgas med hematoxylin och eosin för att bestämma histologiska förändringar och kan också användas för immunhistokemisk färgning.

7. Representativa resultat

Human pankreas neuroendokrina tumörcellinjer BON-1 (ges till Verto institutet av Kjell Öberg, Uppsala universitet, Sverige), QGP-1 (Japanese Health Sciences Foundation, Osaka, Japan) och human lung neuroendokrin tumör cellinje H727 (ATCC) var odlas på ett agarose-belagda 24-brunnars platta. Såsom framgår av fig 1, de tre cellinjerna visar olika morfologi. Bon-1 och H727-celler bildas 3D sfäroider. Under mikroskop visade H727 cellerna tätare och mer kompakt sfäroider än Bon-1-celler. Vår hypotes är att H727-celler har en ökad kapacitet för cell-cell-adhesion och bilda hårdare korsningar som följd. QGP-1-celler visar stora druv-liknande porösa massor, som inte betraktas som sfäroider. På grund av den ökande intresse bukspottskörteln neuroendokrin tumör forskning under senare år, Bon-1-celler som används för resten av siffrorna. Efter ympning Bon-1-celler på agaros-belagda 24-brunnars platta, inträffar flercelliga sfäroider bildas typiskt genom den 3: ^e eller ^{4: e} dagen och de sfäroider bli rundare av ^{6: e} dagen. På grund av det näringsämne och syre begränsning, celler i tät kärna av sfäroiderna börjar dö omkring dag 10 och dag 17, sfäroiderna börjar sönderdelas på grund av den stora storleken eller såme fall utstötning av nekrotisk kärna. Sfäroiderna typiskt kan bli upp till 1000 | im i diameter. Figur 2 visar de delar av bildning, tillväxt och sönderdelning av Bon-1 3D sfäroider.

Läkemedelsbehandlingar inleddes när sfäroiderna var ca 300-400 m och celler bibehållen hög lönsamhet (manuskript under utarbetande). Dag 6 3D sfäroiderna valdes som startpunkt för läkemedelsbehandlingar. Det har rapporterats att histondeacetylashämmare visade antiproliferativa och proapoptotiska effekter på NET cellerna. Vi valde histon-deacetylase inhibitor-trichostatin A (TSA) som ett exempel för att illustrera effekten av läkemedelsbehandling på 3D Net sfäroider. Figur 3A visar ⁶ morfologin hos 3D sfäroiderna vid behandling av TSA. Figur 3B visar volymen av de 3D-sfäroiderna vid TSA (Sigma, T8552) behandling. Storleken på varje individuell sfäroid uppskattades automatiskt genom en kundTom-utvecklade MATLAB datorprogram. ⁴ En manuell ritning steget tillsattes för att hjälpa förvärva sfäroiderna, som var nära kanten i en given bild. Minst 8 sfäroider mättes per dos om TSA behandlingar vid varje tidpunkt. Volymen för varje 3D sfäroid beräknades som 0,5 x Längd x bredd ^2. Såsom ses i Figur 3A och 3B, i förhållande till fordonet, visade alla doser av TSA som visas i figurerna viss grad av inhibering av tillväxten av Bon-1 3D sfäroider. Bland dem, undertryckte de koncentrationer av 125 nM och 250 nM TSA starkt tillväxten av 3D sfäroider och ledde till celldöd vid 96-h tidpunkt.

För att förstå histologi av NET 3D sfäroiderna, H & E och immunohistokemisk (IHC)-färgning en utfördes på 3D sfäroider som hade odlats under 17 dagar. Figur 4A illustrerar en metod för att behandla 3D sfäroider för HistoGel inbäddning, vilket är den viktigaste steg för paraffininbäddning av 3D Spher OID: er. Figur 4B visar H-& E-färgning, det immunohistokemisk färgning av den kluvna kaspas-3 (en markör för apoptotiska celler) och Ki-67 (en markör för prolifererande celler) antikroppar på 3D sfäroider, som hade odlats i 17 dagar . Cellerna i kärnan av 3D-sfäroiderna är mestadels nekrotiska / apoptotiska och det yttre lagret cellerna aktivt breder ut sig.

Figur 1. Morfologin hos NET 3D sfäroider. 3D sfäroiderna från tre humana neuroendokrina tumörcellinjer är bildade på agaros-belagda 24-brunnsplattor. 1000 BON-1, H727 och QGP-1-celler såddes på agaros-belagda 24-brunnar och odlas i ett normalt fysiologiskt tillstånd som beskrivs i protokollet. Dessa är de bilder av 3D sfäroiderna för Bon-1 och H727 eller cell aggregat för QGP-1, som odlades i 10 dagar.

18/4218fig2.jpg "alt =" Bild 2 "/>
Figur 2. Tillväxt spårning av Bon-1-3D Sfäroider Tillväxten uppföljning av Bon-1 3D sfäroider. Bildning, tillväxt och upplösning av 3D-sfäroider. Som beskrivs i protokollet, 1000 BON-1-celler ut på en agaros-belagd 24-brunnar. Cellerna odlas i ett standard DMEM/F12 medium med 10% FBS på en orbitalskakare vid ett fysiologiskt tillstånd över natten, sedan förflyttas på en stabil plattform och odlas i samma tillstånd. Tillväxten spårning av 3D cellerna följdes av avbildning celler varje timme för första 5 h efter plätering och därefter var 1-3 dagar med en Zeiss Axiovert 200/M-based faskontrastmikroskop med en 5x mål. Cellerna sammanlagda in massor först, sedan bilda flercelliga aggregat, små sfäroider, större sfäroider och så småningom sfäroiderna upplösas.

Figur 3. TSA Behandling om Bon-13D sfäroider. (A) Bilder från 3D sfäroiderna vid TSA behandling. Behandling Grupp: V - Fordon (0,0025% DMSO), D1-dos 1 (15,625 nM TSA), D2-dos 2 (31,25 nM TSA), D3: dos 3 (62,5 nM TSA), D4: dos 4 (125 nM TSA ), D5: dos 5 (250 nM TSA). Tid för behandling: 0 H - Tidpunkt att behandlingar startade på dag 6 3D sfäroiderna, 24 H, 48 H, 72 och 96 timmar är de tidpunkter efter behandlingarna startade. 3D sfäroiderna avbildas vid varje tidpunkt som tidigare. (B) Tillväxt av 3D sfäroiderna vid TSA behandling. De stora (L) och mindre (W) axlar 3D sfäroiderna i (A) uppskattades automatiskt av Matlabprogram vid varje tidpunkt av behandlingar (0, 24, 48, 72 och 96 h). Volymen av 3D sfäroiderna uppskattades till 0,5 x L x B ^2. Volymen av sfäroiden i grafen var genomsnittet av 8 replikat och felstapel beräknades bas på 8 replikat.

Tabell 1.Layout av läkemedelsbehandlingar på en 24-brunnsplatta

Figur 4A. Illustration av en metod för att bearbeta 3D Sfäroider för HistoGel inbäddning. En metod att bearbeta 3D-sfäroider för HistoGel inbäddning och immunhistokemisk färgning av 3D-sfäroiderna (A) En översikt av en metod för att bearbeta 3D-sfäroider för HistoGel inbäddning. 3D sfäroiderna inkapslade i en HistoGel vara på samma nivå i biopsi cryomolden, då HistoGel / sfäroiderna blocket insvept i en blå Bio-wraps och överförs till en gul biopsi kassett för paraffininbäddning.

Figur 4B. H & E-färgning och immunhistokemisk färgning av dag-17 3D sfäroider. (B) H & E-färgning, Immunohistokemisk färgning av Ki-67 och klövs caspas-3 i de 17-dagars 3D sfäroider. Den paraffin-inbäddade sektionerade Objektglasen avparaffinerades och antigenåtervinning utfördes med hjälp CCI (Cell Conditioning lösning, Verana Medical System, # 711-065-152). Kanin polyklonal Ki-67-antikropp (# Abcam. Ab833) och spjälkades Caspas 3-antikropp (Cell Signaling Technology, # 9661) applicerades vid en koncentration av 1:75 och 1:200 respektive i 1 h vid rumstemperatur. Anti-kanin sekundär antikropp (Jackson Immunolab, # 711-065-152) applicerades vid 1:500 i 1 h vid rumstemperatur, följt av kromogent detektionskit DABMap (Ventana Medical Systems, # 760-124). Objektglas motfärgades med hematoxylin och uttorkad och rensas innan täckglas från xylen.

Discussion

Vi har visat en enkel, pålitlig och reproducerbar metod för att bilda 3D multicellulär sfäroid från humana neuroendokrin tumör-celler med användning agaros-belagda 24-brunnsplattor. Framgången med denna teknik är möjligheten att få en enda sfäroid med homogen storlek och jämn form genom dag 6 med utgångspunkt från ett fast antal celler. Nyckelsteget är långsam omröring av plattan med NET-celler för den första 16-24 h efter utstrykning. Denna metod kan också tillämpas på vanligt human bröstcancer-cellinjen MCF-7, humant kolon-adenokarcinom-cellinje HT-29, humant icke-småcelligt lungkarcinom-cellinje H1299 och humana embryonala njur-cellinjen HEK-293. De kan alla bilda enhetliga och kompakt 3D sfäroider för terapeutiska läkemedel skärm (data ej visade). Även om flera metoder redovisas på att generera 3D-sfäroider, rapporterade ^7-10 metoden här inte kräver specialiserade plattor eller reagenser och är därmed enkel och kostnadseffektiv. Vår opublicerade data demonstrerae att NET 3D sfäroider som odlas på agaros efterlikna in vivo NET xenotransplantat tumör geometriskt och molekylärt, vid jämförelse med monolager 2D-celler. Detta liknar vad som rapporterats för 3D sfäroiderna gjorda av andra humana cancerceller cellinjer. ^11,12 Begränsningen av 3D-cellodling modellen är att den inte helt kan ersätta testa in vivo effekten av eventuella läkemedel eller terapeutiska behandlingar eftersom 3D sfäroiderna är som avaskulära tumörer, som skiljer sig från den in vivo tumör i denna aspekt. Kommer dock denna metod bidra till att överbrygga klyftan och bedömningar av NET terapeutiska läkemedel från in vitro till in vivo i vissa avseenden.

Immunofluorescens-färgning för flercelliga sfäroider är mycket svårt att utföra på grund av den stora storleken och geometrin hos de flytande 3D sfäroiderna, och begränsningen av det konfokala mikroskopet. Här illustrerar vi en metod för att bearbeta HistoGel inbäddning för paraffininbäddning, vilket möjliggör immunhistokemisk färgning av de seriella sektionerade diabilder av 3D sfäroiderna. Dessutom bidrar våra kunder utvecklat MATLAB-program korrekt och reproducerbart uppskatta storleken på sfäroiderna, övervaka läkemedlets effektivitet effektivt och kan ingå i en hög genomströmning skärm i utvecklingen av läkemedel för NET patienter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 Media	Gibco	10565-018
TrypLE	Gibco	12604
24-well plates	Falcon	353047
70 mM cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Sterile sealing tape	Nunc	236366
Trichostatin A	Sigma	T8552
Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-402-12