Summary
Den presenterte fremgangsmåte tilbyr en måte å detektere funksjonelle effektive cardiotropic autoantistoffer i plasma av pasienter med dilatert kardiomyopati, uavhengig av den spesifikke antigen, ved å analysere effekten av isolert pasient immunoglobulin på cellulære matfett og intracellulære kalsium transienter i isolerte rotte cardiomyocytes.
Abstract
Dilatert kardiomyopati (DCM) er en av de viktigste årsakene til hjertesvikt hos yngre voksne en. Selv om genetisk disposisjon og eksponering for giftige stoffer er kjent årsaker til denne sykdommen hos omtrent en tredel av pasientene, forblir opprinnelsen DCM stor grad uklart. I et betydelig antall av disse pasientene har autoantistoffer mot hjerte-epitoper blitt oppdaget og er mistenkt for å spille en sentral rolle i utbruddet og progresjon av sykdommen 2,3. Betydningen av hjerte autoantistoffer understrekes av en hemodynamiske forbedring observert i DCM pasienter etter eliminering av autoantistoffer ved immunoadsorption 3-5. En rekke spesifikke antigener har allerede blitt identifisert 2,3 og antistoffer mot disse mål kan påvises ved immunoanalyser. Imidlertid kan disse analysene ikke diskriminere mellom å stimulere (og derfor funksjonelt effektive) og blokkerer autoantistoffer. Det er økende evidence at dette skillet er avgjørende 6,7. Det kan også antas at målene for en rekke cardiotropic antistoffer fortsatt uidentifiserte og kan derfor ikke bli detektert av immunoanalyser. Derfor etablerte vi en fremgangsmåte for påvisning av funksjonelt aktiv cardiotropic antistoffer, uavhengig av deres respektive antigen. Bakgrunnen for fremgangsmåten er den høye homologi vanligvis observeres for funksjonelle regioner kardiale proteiner i mellom pattedyr 8,9. Dette tyder på at kardiale antistoffer rettet mot humane antigener vil kryssreagere med ikke-humane målceller, noe som tillater testing av IgG fra DCM pasienter på voksen rotte cardiomyocytes. Vår metode består av 3 trinn: først, IgG isolert fra pasienten plasma med Sepharose coupled anti-IgG-antistoffer hentet fra immunoadsorption kolonner (PlasmaSelect, Teterow, Tyskland). Second, voksen cardiomyocytes er isolert etter collagenase perfusjon i en Langendorff perfusjon apparat med aprotocol endret fra tidligere arbeider 10,11. De oppnådde cardiomyocytes er festet til laminin-belagte Chambered coverglasses og farget med Fura-2, en kalsium-selektiv fluorescerende fargestoff som lett kan bringes inn i cellen for å observere intracellulær kalsium (Ca2 +) innholdet 12. I det siste trinnet, effekten av pasienten IgG på cellen matfett og Ca 2 + transienter av feltet stimulerte cardiomyocytes overvåkes elektronisk ved hjelp av en kommersiell myocyte kalsium og kontraktilitet overvåkingssystem (IonOptix, Milton, MA, USA) koblet til en standard invers fluorescerende mikroskop.
Protocol
1. IgG Isolasjon fra pasientprøver
- Forbered mini-immunoadsorption kolonner ved å fylle 3 ml anti-IgG sefarose per 2 ml pasient EDTA plasma inn i en tom Econo Pac kolonne. IgG isolasjon krever minst 2 ml av pasientens plasma.
- Plasser en filter på toppen av den anti-IgG Sepharose, kutte åpne den nedre tuppen av kolonnen og trykk på filteret for å nå en strømningshastighet på ca 1 dråpe / sek. La bevaring løsning kjørt ut av kolonnen.
- Vask kolonnen med 3 volumer 0,9% NaCl per volum av plasma.
- Pipetter plasma på kolonnen. Når plasma har helt midt i anti-IgG Sepharose, vask med samme volum 0,9% NaCl.
- Pipetter en plasma volum av 0,2 M glycin-HCl, 2,8 pH på kolonnen og la dyppe inn i Sepharose. Legg annet volum av glysin HCl på kolonnen. Samle strømningen gjennom i et 15 ml rør og justere pH til 7,3 med 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0.
- Å regenerere kolonne, Vask med 3 plasma volumer glysin HCl. Etter en endelig vask med 2 volumdeler 0,9% NaCl, kan kolonnen anvendes for neste plasmaprøve. Alternativt kan kolonnen fylles med bevaring løsning og lagret ved 4-8 ° C i opp til 4 uker.
- For bruk på cardiomyocytes har oppsamlet IgG fraksjonen skal dialysert mot eksperimentell buffer (EB). For fremstilling av EB, legge 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgCl 2, 1,2 mM KH 2 4 PO, 1,2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES og 20 mM glukose til 1 L destillert vann på en magnetrører, og justere pH til 7,3.
- Fyll IgG fraksjonen til en celluloseester dialysemembran tube med en molekylvekt avskåret av 100 kDa. Sette røret i 1 L EB og rør langsomt med en magnetrører ved 4 ° C. Etter 8 timers, overføre dialyse slangen inn 3 L av fersk EB og Dialyser for en annen 20 timer ved 4 ° C.
- Etter dialyse, varme prøven i 30 minutter ved 57 ° C i et vannbad for å inactivate komplement faktorer. Bestem total IgG konsentrasjon og forberede alikvoter inneholder 330 mikrogram IgG hver. Når du legger utvalget til cardiomyocytes for måling (trinn 4.3), fyll opp alikvoter til 1 ml med EB. Ufortynnede alikvoter kan lagres ved -20 ° C inntil videre bruk.
2. Isolering av Rat cardiomyocytes
- For fremstilling av Ca 2 +-fri isolasjon buffer (IB), tilsett 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES og 11 mM glukose til 1 L destillert vann ved hjelp av en magnetisk rører. Justere pH til 7,4 ved romtemperatur og filtrer gjennom et 0,2 um flaskekorken filter for sterilisering.
- Fyll 80 ml IB i det øvre reservoaret av en termostatstyrt Langendorff perfusjon system. Juster termostat innstillinger å opprettholde en buffer temperatur på 37 ° C og lufte buffer med 95% O 2/5% CO 2 i 30 min.
- Vei ca 10.000 - 12000 U av collagenase type II, 175 mg fettsyre fri BSA og oppløses i 20 ml IB inneholdende 22,5 pl av en 100 mM CaCl 2 stamløsning. Kontrollere pH av isolasjon buffer i det øvre reservoaret og juster hvis nødvendig.
- Anaesthetize en Wistar-rotte av 175 - 200 g med 375 ug / kg kroppsvekt tiopental. Legg 2500 IU Heparin til thiopental løsning. Etter torakotomi, avgiftsdirektoratet hjertet forsiktig med en intakt aortabuen og overfør det til iskald 0,9% NaCl. Rengjør hjertet fra blod og omkringliggende vev, og overføring til frisk 0,9% NaCl. Eksponer aorta, åpne flyten redusering av Langendorff anlegg for å få slippe hastighet 2-3/sec og fest hjertet til kanylen.
- Perfuse hjertet for opptil 3 min med en strømningshastighet på 1 dråpe / sek for å vaske ut gjenværende blod. Begynner å sirkulere de IB i Langendorff systemet. Fjern 20 ml buffer fra det øvre reservoaret, fyll i kollagenase løsningen og refill som mye buffer som kreves for å nå 80 ml. Sirkulere c ollagenase løsning for en annen 27 min. Strømningshastighet bør kontrolleres med jevne mellomrom og holdt ved en dråpe / sek ved hjelp av flyten redusering.
- Løsne hjerte fra kanylen, rent fra atriene og aorta og hogge i små biter. La collagenase løsningen til å kjøre inn det nedre reservoaret, reduser volumet til maksimalt 40 ml og ytterligere fordøye hakkede ventriklene i 10 - 15 min under kontinuerlig lufting med 95% O 2/5% CO 2. Etterpå, filtrer cellesuspensjonen gjennom en 200 um maskevidde gasbind til en 50 ml rør.
- Gjenopprette Ca 2 + innholdet av cellene i 3 trinn: sentrifuger cellesuspensjonen ved 43 xg i 2 min ved romtemperatur og resuspender cellene i 10 ml IB inneholdende 200 uM CaCl 2. Sentrifuger igjen og resuspender celler i 10 ml IB med 500 mikrometer CaCl 2. Etter en endelig sentrifugering resuspender cardiomyocytes i sterilfiltrert EB (se 1.8) til en densitet på 50.000 celler / ml.
- Coat en 4 godt kamret coverglass med 10 mikrogram laminin per brønn og vent til den er helt tørket.
- Fyll 1 ml av cardiomyocyte suspensjonen i hver brønn med en mikropipette med et kutt tips. La cellene å overholde i 1 time ved romtemperatur.
- Fortynn 10 pl av 1 mg / ml Fura-2 AM stamløsningen i 5 ml EB. Hold farging løsningen i mørket.
- Ta av buffer og unattached celler fra coverglass og pipetten 0,5 ml av den farging oppløsningen i hver brønn. Inkuber cellene i 10 minutter under moderat risting. Deretter, ta av det farvende løsning, vaske cellene én gang med 1 ml EB og endelig fylle 0,5 ml EB i hver brønn. Unngå direkte lys under farging prosessen og alltid holde fargede celler i mørket.
4. Innspillingen av Cell Avkortning og Ca 2 + transienter
- Plasser kammer coverglass på en omvendt fluorescens microscope koblet til en myocyte kalsium og kontraktilitet opptakssystem. Plasser en skreddersydde elektrode med en strøm og effluks rør i den første brønnen. Superfuse cardiomyocytes med 1 ml / min EB og starte den elektriske stimulering (20 V, 1 Hz, 5 msek varighet). La cellene å tilpasse seg stimulering for ca 2 min.
- Velg en intakt stavformede cardiomyocyte med klar striation og konstant sammentrekning. Plasser cellen i sentrum av synsfeltet og åpne kameraet kanalen. Orientere cellen horisontalt i videoen området ved dreie cellen framing adapter og flytte mikroskopet scenen.
- Juster kanten oppdage kontrollere elementer på video området (figur 2), åpner den fluorescerende kanal og ta opp 10-15 sammentrekninger å oppnå opprinnelig celle fett og Ca 2 + forbigående.
- Lukk mikroskop lyse kanal for å unngå bleking av fluorescensen flekken. Slå flyten gjennom fra EB til prøvenbypass med en 3-veis ventil og superfuse cardiomyocytes med 1 ml av pasientens IgG. Stoppe pumpen like før luften når brønnen.
- Åpne lyset kanal og ta opp en annen 10-15 sammentrekninger å få akutt celle respons. Pause innspillingen og lukker lyset kanalen igjen. Gjenta opptak etter 2 og 5 min.
- Ta ut elektroden av brønnen. Rengjør rørene grundig med EB og fortsette med neste brønn kammer coverglass.
- Analyser cellen matfett og Ca2 + forbigående med IonWizard programvaren ved hjelp av "Edge-Length/Length" og "2-fura Numerisk subtrahert / Ratio" vindu, henholdsvis. Beregn den prosentvise endring fra den opprinnelige cellen matfett og Ca2 + forbigående av topphøyden henvist til grunnlinjen (bl% peak h) for den akutte, den 2 min og 5 min respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To eksempler for måling av cellulær inotropi i felt stimulert voksne cardiomyocytes (figur 2) ved hjelp av en myocyte Ca 2 + og kontraktilitet opptakssystem er gitt nedenfor. Figur 3 gir et inntrykk av en kontrollmåling, mens i figur 4 virkningen av cardiodepressive antistoffer av en pasient med DCM vises.
I begge eksemplene, innledende celle forkorte og Ca 2 + forbigående under superfusjons med EB viser klare og konstant topper, som er en forutsetning for analysen. Vi vet av erfaring at cellene stiller en innledende bl% peak h i området 7-14% passer best for søknaden vår, mens cardiomyocytes med lavere eller høyere innledende kontraktilitet ofte har en tendens til å vise uprovoserte endringer av cellen fett. Etter påføring av kontroll IgG, dvs. IgG isolert fra friske kontrollpersoner, forblir inotropi av cardiomyocytes unendret gjennom hele målingen (Figur 3A). I kontrast er superfusjons med IgG inneholdende cardiodepressive antistoffer etterfulgt av en reduksjon av celle matfett (figur 4A), ledsaget av reduksjon Ca 2 + transienter som normalt er mindre uttalt (figur 4B). Vi vanligvis observere at en ny stabil tilstand er etablert for begge, celle matfett og Ca 2 + transienter, etter 2 min som er konservert til slutten av målingen etter 5 min. Den oppgitte eksempelet viser en veldig klar negativ inotrop effekt med en nedgang på celle forkorte med 54% og av Ca 2 + transienter med 31% etter 5 min. Men endringer er ofte mindre uttalt. Derfor, definerte vi en øvre og nedre grense for negativ og positiv inotropi som gjennomsnitt ± 2SD for kontroll IgG av en sunn kontrollgruppe for å unngå falske positive resultater. Følgelig er celler bare betraktes som negativ eller positiv inotrop whøne endringer av cellen forkorte overstiger denne grensen, som vi fast bestemt på å være ca ± 10%.
Figur 1. Flytskjema over autoantistoff deteksjon ved å måle cardiomyocyte kontraktilitet. Først IgG hentet fra pasientprøver med anti-IgG Sepharose kolonner (merket med gult). Sekund, er cardiomyocytes isolert fra rottehjerter ved enzymatisk fordøyelse og farget med Fura-2 (uthevet i blått). Endelig celle fett og Ca 2 + transienter overvåkes nettet ved hjelp av en myocyte Kalsium og kontraktilitet Recording System (uthevet i grønt).
Figur 2. Isolert rotte cardiomyocyte posisjonert i videoen området av myocyte kontraktilitet Recording System. Grafen nedenfor viser cellen beregnede intensitet spor som brukes for kantdeteksjon. Pilene angir edge oppdage betjeningselementer. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Representativt eksempel på en kontrollmåling. Cell matfett (A) og Ca2 + forbigående (B) ble overvåket på nettet før (initial), umiddelbart (akutt), 2 minutter og 5 minutter etter superfusjons med IgG. Røde linjene indikerer pause av målingen.
"Figur 4" fo: content-width = "4.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/4237/4237fig4highres.jpg" />
Figur 4. Eksempel måling av en IgG prøve inneholdende cardiodepressive antistoffer. Cell matfett (A) og Ca2 + forbigående (B) ble målt på nettet før (initial), umiddelbart (akutt), 2 minutter og 5 minutter etter superfusjons med IgG. Røde linjene indikerer pause av målingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte fremgangsmåte tilbyr en egnet måte å oppdage funksjonelt effektive kardiale autoantistoffer i pasienter med DCM for uklar opprinnelse. I forhold til andre metoder, f.eks påvisning av funksjonelle aktive antistoffer mot β1-adrenoseptor ved deres innvirkning på cAMP nivåer 6, er vår metode uavhengig av en bestemt epitop. Selvfølgelig finnes det andre epitop uavhengige analyser beskrevet i litteraturen, dvs. telle slo frekvensen av neonatale cardiomyocytes 13, måling kalsium strømmer i voksen cardiomyocytes av patch clamp teknikk eller kontraktilitet av isolerte Purkinjefibre 14. I fordel med disse metodene, er analysen presentert her mindre tidkrevende og gir økt objektivitet grunnet den standardiserte protokollen. Videre tillater det detektere virkningen på kontraktilitet og intracellulær kalsium transienter samtidig.
I likhet med othenne i vitro, kan resultatene oppnådd med den presenterte metodens bli utfordret av kunstige forhold anvendt til cellene. Kulturperler neonatal rotte cardiomyocytes ble rapportert å feste fortrinnsvis mellom micropillars med en avstand på 30 mikrometer eller mindre enn på flate underlag. Når festet til sistnevnte, ble celler funnet å vise aktin stressnivået fibre og sorterte myofibers 15. Imidlertid beskrev den potensielle virkningen av stress fiber i kontraktilitet analysen her kan være ubetydelig siden voksen cardiomyocytes kun kultivert for en svært kort tidsperiode på opptil 6 hr som kan redusere dannelsen av slike fibre og celle forkorting og Ca 2 + forbigående henvises til den opprinnelige kontraktilitet av den respektive cellen å minimere påvirkningen av individuelle forskjeller mellom celler. En annen begrensning er den høye etterspørselen av forsøksdyr og tid. Derfor metoden er ikke egnet for high-throughput screening av Patientene.
Ytterligere implementeringer er tenkelig for metoden. Grunnet antigen-uavhengighet det kan brukes på andre idiopatiske kardiovaskulære sykdommer, hvor en autoimmun tyngre antas.
Dessuten kan kontraktilitet målinger enkelt justeres til å studere funksjonelle effekter av andre stoffer. Dette gjør at analysere en potensiell effekt av legemidler på hjertet, noe som kan være fordelaktig for eksempel i narkotika utvikling og testing. Foruten de grunnleggende parametrene gitt av endringer i celle fett og Ca 2 + fra baseline, kan ytterligere informasjon fås fra målinger som tillater en mer detaljert definisjon av den observerte effekten. For eksempel, kan den avgang og retur hastighet beregnes fra cellen forkortelse hendelser som kan indikere en bestemt systolisk og diastolisk effekt av et medikament eller antistoff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), den føderale departementet for økonomi og teknologi-prosjekt ZIM-KF 2727801MD0 og Senter for Innovasjon Kompetanse - humorale immunresponser i hjerte-og karsykdommer ( ZIK-tur, BMBF FKZ 03Z2CN12) av Federal Utdannings-og forskningsdepartementet, Tyskland. Bolig og eksperimenter med dyr ble utført i samsvar med anbefalingene fra Society for Laboratory Animal Science (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) og Federation of European Laboratory Animal Science Association (FELASA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
- Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
- Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
- Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
- Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
- Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
- Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
- Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
- Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
- Piper, H. M. Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1990).
- Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
- Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
- Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
- Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).
