頭蓋間葉の細胞挙動を評価するための外植片アッセイ

Summary

頭蓋間充織は、おそらく神経ヒダの上昇のための駆動力を提供する劇的な形態形成運動を起こす

Abstract

中枢神経系は、神経胚形成として知られているプロセスの神経管が形成される複雑な形態形成の一連の動きを受け、神経板から派生しています。神経胚形成時には、神経板の根底にある間葉の形態形成は、神経倍上昇を駆動するように考えられている。頭蓋間充織は沿軸中胚葉および神経堤細胞から構成されています。頭蓋間葉形の細胞が神経襞を支える肝星状細胞と混ざり、細胞外マトリックス（ECM）のストランドから成るpourous網目構造。神経胚形成の間、頭蓋間充織は、その拡大をもたらし陳腐な再編成を経て、これらの動きは、神経倍上昇させるための駆動力を提供すると考えられている。しかし、頭蓋間葉の形態形成を駆動する経路と細胞行動はあまり研究されたままになります。 ECMと頭蓋の間充織基礎となるthesの細胞間の相互作用E細胞の挙動。ここでは、これらの細胞の挙動を特徴づけるために考案されたシンプルなex vivoで植検定について説明します。このアッセイは、さらに、これらの細胞の挙動を特徴づけるために関与するシグナル伝達経路とライブイメージング解析を解剖する薬理学的操作に修正可能です。我々は、ECM成分の様々な頭蓋間充織の遊走特性を特徴付ける際に、このアッセイの有用性を実証した代表的な実験を紹介する。

Introduction

頭蓋領域における神経管閉鎖は胎生8.5（E8.5）とマウス胚では9.5の間で発生します。適切に無脳症、ヒトの共通の構造先天性欠損症で頭結果に神経管を閉じてしないと、人生とは互換性がありません。頭部神経管閉鎖を駆動力は神経組織自体や周囲の表皮と間充織^3の両方から生成されます。頭蓋間葉の特定の拡張では頭部神経襞^1,2の上昇のために不可欠であると考えられている。頭蓋間充織は、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸やヒアルロン酸^4月8日のような特定のグリコシル化タンパク質でECMタンパク質を豊富に含んでいます。

神経堤細胞は神経管閉鎖後に神経管背側から移住ニワトリ胚の場合とは異なり、マウス胚の神経堤は神経襞がrに開始と同時に移行ISE（5体節期の後）。マウス胚における神経胚形成の間にこのように、頭蓋の間葉は神経堤と沿軸中胚葉由来の細胞で構成されています。神経堤と沿軸中胚葉集団は、開発中の異なる時期に誘導され、胚の異なる位置に局在し、異なる構造^9,10へと発展する。沿軸中胚葉は原始線条由来すると推定される神経板の根底にある胚の前方領域に移行されます。神経堤は神経板と表皮外胚葉の合流地点に誘導され、間葉移行をする上皮を経て、げっ歯類の胚における神経倍上昇の直前に離層。神経堤細胞は鰓弓、frontonasal及び眼周囲の間葉へsubectodermal沿軸中胚葉における常同経路に沿って移行します。沿軸中胚葉は、頭蓋骨のボルトと顔の筋肉の骨の一部に貢献していきます。番目のに対し、電子神経堤は脳神経^9月11日に加えて、頭蓋骨や顔の他の骨に貢献していきます。沿軸中胚葉および神経堤系統は差はそれぞれ^{9、Mesp1-CRE}とWnt1-Creトランスジェニックマウス系統でマークすることができます。

神経管閉鎖における頭蓋間葉の重要な役割は、ECMとげっ歯類の胚の治療は、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼABC、神経胚形成損なわ神経管閉鎖⁷時ヘパリチナーゼまたはジアゾ-オキソ-ノルロイシン^（DON）、などの薬剤を中断した実験から推測されている^12月14日 。これらの実験では、神経胚形成に続く静的セクションの組織学的分析は頭蓋間葉^7,12-14の関連dysmorphogeneisを明らかにした。催奇形性薬剤が複数の組織へのアクセスを持っていたしかし、それは頭蓋間充織が本当に標的組織である場合、決定されていない。結論を支持して、この組織神経胚形成のために不可欠であり、頭蓋間充織は、脳脱出^15から17といくつかのマウス変異体における組織学的分析時に異常な表示されます。それでも、ほとんどの場合、頭蓋間充織の細胞挙動に対する突然変異の効果が解決されていません。

我々は、直接頭蓋間葉細胞¹⁵の挙動に遺伝子突然変異または薬理学的操作の結果を調べるためにex vivoでの植検定を考案した。我々は前方神経の根底頭蓋間充織のより前方集団の回遊特性を研究するために植解剖を変更した場合を除き、このアッセイは、根底rhombomeres ¹⁸その頭蓋の間葉の分化能にアクセスするTzahor ら 2003年までに発行されたものと同様であるプレート。我々の手法はまた、KEと神経堤の回遊行動を分析するためにニワトリ胚で行わ植アッセイの変形例であり、yの違いがあります。前準備は神経堤以上後方沿軸中胚葉^19,20を植しました。さらに、ニワトリ胚における神経倍上昇中に、神経堤はまだ神経管背側から移住していないので、前方沿軸中胚葉の取ら外植片は、神経堤細胞が含まれていませんでした。我々のアッセイでは、沿軸中胚葉、神経堤と表面外胚葉から成る頭蓋間葉外植片は、基板上に作製し、メッキされています。遺伝的変異体からの外植片の分離、異なるECMまたは薬理学的治療上の外植片をめっきを含む実験的操作を行うことができます。外植片との距離、数や行動からの細胞の移行を分析し、治療群間で比較することができます。また、この準備は、ライブイメージング技術による細胞遊走の分析に修正可能です。毛皮への移行実験の後、外植片を固定することができますし、免疫組織化学分析に供治療の効果を明らかTHER。全体的に、ここで紹介するプロトコルは頭蓋間充織の振る舞いを調べるための簡単なex vivoでアッセイである。代表的な実験として、我々は別の細胞外基質上の頭蓋間充織の移行を調べるには、このアッセイを利用しています。

Protocol

1。 ECMコート培養皿またはカバーガラスの作製

1. PBS中のECM基板（ダルベッコの生理食塩水、インビトロジェン、＃14040から133をリン酸緩衝）を溶解させてECMのストック溶液を調製します。 -80℃で0.2ミリメートルシリンジフィルター（VWR、＃28145から495まで）、アリコートで凍結℃を使用してフィルタ
2. PBS中で所望の濃度にECMの原液を希釈します。 MaxGelは、DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地、インビトロジェン、＃11995から065）で希釈してください。
3. 免疫が実行される場合には、エタノールに浸漬することにより、12ミリメートルの円形カバーガラス（VWR、＃89015から724まで）を殺菌し、空気乾燥することができます。これは、無菌層流フード内で行う必要があります。免疫を行わない場合には1.5に進みます。
4. 24ウェルプレート（コーニング、＃3526）の各ウェルに滅菌カバースリップを置きます。
5. 3時間室温で24ウェルプレートでインキュベートの各ウェルに希釈した基質溶液0.5mlを追加します。
6. ECMソリューションおよび洗浄THREを吸引PBS中でのe倍。
7. PBSを吸引し、すぐに使用するか、パラフィルムで包み、4℃で2週間まで保管。

2。解剖ツールの準備

追加された木炭とシルガードプレートは、製造業者のプロトコルごとに用意されている。これらのプレートの抵抗力が黒の背景には、胚を押さえつけるためのサポートを提供し、色は半透明の胚を可視容易に良好なコントラストを提供しています。

1. プレートを準備するには残高150グラムパーツのトライ注ぐビーカー液体15グラムパートBと1グラムの炭粉（世界精密機器、＃SYLG184）に直接量る。木製のアイスキャンデーの棒または舌圧子を用いて一緒に混ぜる。ガラスまたはプラスチックの100 cmの皿に注ぎます。皿上約10〜12インチは、任意の気泡を焼き切るために開催された小さなブタントーチを使用しています。場所は、プレート上のふたおよび設定するには、少なくとも24時間放置します。
2. （0.1 mmのdiamete Minutienピンインサート解剖ツールを準備するにはr）のピンホルダー（ファイン科学ツール、＃26002から10と＃26018から17、それぞれ）に交互に26ゲージ針（BD、＃309597）は、鉗子を用いて直角に曲げ解剖楽器として使用することもできる。研ぎ石（ファイン科学ツール、＃29008から22）を使用して学生デュモン＃5鉗子（ファイン科学ツール、＃91150から20）を削った。
3. 使用前に70％エタノールを用いてすべての解剖ツールを殺菌。

3。胚のコレクション

1. 動物使用委員会の規制に従って8.5日後coitumで時限妊娠マウスを安楽死させると子宮を取り除く。
2. 滅菌PBSでプラスチックシャーレに入れ、子宮。
3. 滅菌PBSで一度子宮を洗浄する。
4. 解剖顕微鏡下で慎重にピンセットを使用してdeciduasから胚を削除します。
5. 胚体外膜を取り外し、必要に応じてジェノタイピングのために保存。
6. 体節を数えることによって段階の胚。携帯BEHを分析するために外植片を作るために理想的な段階ニューラル倍上昇時aviorは、神経ヒダがちょうど昇格し始めていると頭蓋の間葉の主要な形態形成が行われる前に6と10体節のステージの間になります。
7. PBS中で胚を洗浄します。全くフェノールレッド（インビトロジェン、＃21063から029まで）が含まれていませんDMEMで黒SYLGARDプレートに入れます。胚体外膜を取り外し、必要に応じてジェノタイピングのために保存。

4。外植片の作製

1. 胚の頭部の上、可能な限り最高の倍率で顕微鏡に再び焦点を合わせる。
2. それぞれの手で解剖針でカットを行う。切り傷を作るために一つの場所に組織を保持するために、針およびその他を使用しています。
3. rhombomeresへ前の胚の頭部を切り落とした。
4. 2等分に頭を二分する正中線に沿って切り取ります。
5. 頭と正中線の外側のフリンジの周りにカット。これらのカットは、外側の境界でpremigratoryクレストと表面外胚葉を削除します正中線で脊索前板。残りの組織は、外植片となり、移行頭部神経堤、沿軸中胚葉と表面外胚葉が含まれています。
6. 組織が切断されたように、滅菌パスツールピペットを用いて皿から解剖ホコリを取り除きます。これは、解剖した破片で外植片を混乱させないようにします。
7. 穏やかに20μlのピペットチップとピペットマンで上下ペッティングにより植を洗う。これは緩く付着した細胞を除去し、外植片にギザギザのエッジを防ぐことができます。
8. 慎重によくコーティングされた文化の中心地で20μlのピペットチップとピペットマンと場所を使用して、液体の約10μlの各外植片を拾う。
9. 外植片をカバーするために15％FBSを添加した培地20μlを追加します。
10. 1〜2時間加湿組織培養インキュベーター（5％CO _2、37℃）に入れプレートは外植片は、皿の底に付着することを可能にする。外植片を乾燥しないようにするために定期的に表示外。
11. 外植片が付着したときは、慎重に℃の水浴中で37度に暖めてある10％FBSを添加した各ウェルに250μlのDMEMに追加します。一度外植片は、プレートを穏やかに顕微鏡下で振られたとき、彼らは移動しません添付しました。
12. 組織培養インキュベーターに皿を返します。
13. 24時間後、外植片をしっかりと接続され、細胞が移住を開始します。この時点で薬理学的薬剤は、培地に添加することができます。
14. めっき後の48時間後、細胞を外植片から移行しているだろう。移行距離を可視化し、画像化することができる。外植片は長いインキュベーションと生存率低下の兆しを見せ始めて以来、私たちは通常、この時点で培養を停止します。例えば、アクリジンオレンジまたはトリパンブルーなどの生体染色はまた、外植片の生存を確認するために使用することができます。
15. この時点で画像が外植片からの移行細胞の距離や数を記録するために取得することができます。あるいは、外植片は、カバースリップ上に播種した場合、彼らは固定されており、免疫組織化学的分析は、目的のタンパク質を可視化するために行うことができる。

プロトコルの重要なステップ

1. ほぼ同じサイズの外植片を切り取ります。
2. あなたが希望する外植組織に混乱破片を避けるために解剖される解剖板からすべての解剖破片をクリアします。
3. ウェル内またはカバースリップ上にめっき外植時は井戸の中心で外植片とメディアの滴を配置するようにしてください。
4. メディアでよく氾濫する前に取り付けるために十分な時間を植許す。
5. 処理条件は、使用されるすべてのテスト用基板と薬剤のための標準化されるべきである。
6. 二つの外植片は、各胚（左から1と神経管の右から1）で行うことができます。
7. 異なる実験条件下で変異マウスラインからの細胞の遊走をテストする際には、処理されたグループ内の1つの変異体対照群における外植片と他のを入れた。

トラブルシューティング

1. 外植片は、接続に失敗した場合、添付ファイルに割り当てた時間を増やします。我々の経験では、外植片の約半分は、添付しないと大外植片は、より効率的に付着している。
2. 外植片は、井戸の周囲に付着した場合、彼らは想像し難いでしょう。井戸の中心に植片を配置してください。
3. 理想的には、外植片はほぼ同じサイズになります。しかし、外植片の大きさの不一致は、外植片からの細胞の移行をquanitating時補正係数として植片の直径を用いて補正することができる。
4. 汚染が発生した場合は無菌の労働条件が使用されていることを確認してください。すべてのツールと​​作業面を70％エタノールで滅菌されるべきである。ピペット、ペトリ皿は新しいし、無菌でなければならない。
5. 外植片は解剖中に失わ取得している場合は、定期的に外植片の紛失を防ぐには、ホコリを取り除きます。
6. マスタリング解離は時間がかかり、練習が必要です。オプティMAL倍率、鋭い解剖ツールと針のヘルプを参照してください。

Representative Results

頭蓋間葉外植片からの移行のセルの外観を図2に示します。 、ラミニン（100 mg / mlで、シグマ＃L2020）、MaxGel ECM（DMEM中1:500希釈;我々は、フィブロネクチン（シグマ＃F1141 100 mg / ml）を含む神経胚形成中に頭蓋間充織に存在する様々なECMの基板上にマイグレーションをテスト;シグマ＃E0282）とヒアルロン酸（1 mg / mlで、シグマ、＃53747）。全くECMが存在しないときに細胞が外植片からの移行に失敗した（データは示さず）と全ての基板は、細胞の、サポートされるマイグレーションをテストした。形状だけでなく、外植片からの移行細胞の大きさの両方が基板に依存します。以前の研究では、異なるECMと細胞との相互作用によって生成された機械的な力がセル²¹の形状や渡り鳥のプロパティの両方に影響を与えることを示しているので、これは予想されます。

図1。外植片の調製 （）外植片を準備するには、E8.5胚は胚体外組織とdeciduasから解剖されています。 （B）は、胚の頭部はrhombomeres前方に体から解剖されています。外植片は、それぞれ、正中線と国境でpremigratory神経堤と表面外胚葉で脊索前板を削除するには、正中線と頭の外縁から組織を除去することによって調製される。 （C）の外植片を正中線と国境でpremigratory神経堤と表面外胚葉で脊索前板を削除するには、頭の正中線と外側のエッジから組織を切り取ることによって調製される。 （D）の外植片は、ECMコートディッシュ/カバースリップ上にメディアを少量に入れて、より多くのメディアを添加する前に接続を許可されている。

図2。異なる基板上に播種した外植片から頭部間充織細胞の遊走。植片はフィブロネクチン、ラミニン、MaxGel ECMまたはヒアルロン酸上に播種し、培養液中で48時間後に撮影した。サイズバー= 200 mmである。

Discussion

ここで適用された方法は、頭蓋の間充織細胞の挙動を調べるための強力なアッセイを提供する。ここで紹介する静的解析に加えて、GFP標識タンパク質の発現と明視野で、または組み合わせてイメージング実験を生きるには、彼らは外植片からの移行のようにリアルタイムでの細胞の挙動を調べるために用いることができる。ライブイメージング実験では、外植片はDIIで標識されていなかったか、沿軸中胚葉、ROSA-YFPから神経堤の移行を区別するために、Mesp1-CreまたはROSA-YFP; Wnt1-Creまたは他のトランスジェニック系統を用いることができる。頭蓋間充-ECM相互作用もまた、この外植片アッセイを利用して調べることができます。ここでは、その細胞が異なる程度にこれらに移行し、ECMは、細胞の形態に影響を及ぼすことを示すことが頭蓋間充織に存在する異なるECMの基板上のプレートの外植片。さらに、外植片はCELの動作にアクセスする三次元マトリックスに埋め込むことができますこの文脈でls。この植アッセイは、移行を調節し、変更することができます内因性および外因性の手がかりを分析するために頭蓋間充織の行動上の遺伝的および薬理学的操作の効果の分析に修正可能です。例えば、私たちはHectd1変異頭蓋間葉¹⁵で異常な細胞行動に過剰分泌のHsp90の役割を識別するため、我々の研究では、このアッセイを利用した。これらの実験では、我々は、抗Hsp90の抗体とHectd1変異細胞の異常行動が過剰な細胞外Hsp90の¹⁵によるものであることを実証するために、Hsp90の分泌をブロックするHsp90の蛋白質、ゲルダナマイシンおよびDMA（ジメチルamelioride）を外植片を処理した。同様のアプローチは、薬理学的に頭蓋間葉の正常または異常な形態形成の基礎となる追加の経路を分析するために使用することができる。アッセイが完了したら、外植片と遊走する細胞は、メソッドのホストにより分析することができる。例えば、免疫組織化学分析C細胞運動のための重要なタンパク質の局在を調べるために使用すること。トランスクリプトーム解析はまた、治療は、遺伝子発現にどのように影響するかを決定するために使用することができる。

この手法には重大な制約があり、それらが生体内で起こるであろうとして、それが3次元でモデルの動作をしないということです。外植片を蛍光タンパク質でマークされた細胞区画の発現と共に三次元マトリックス（ 例えばマトリゲル）に埋め込 ​​まれているプロトコルの変更は、この問題に対処するために必要な使用することができる。これらの変更が行われた場合であっても、 生体内でそれらを使用してこのex vivoのアッセイで見られる挙動を相関させるため、さらなる実験が必要であろう。その他の制限は、静的なデータを生成するために十分な数を生成するために必要な胚が多数含まれています。最も重要なのは、解離は比較的簡単ですが、それはマスターに練習を必要としません。