En Eksplantation Assay for vurdering Cellulær Behavior af Cranial mesenkym

Summary

Den kraniel mesenkym undergår dramatiske morfogene bevægelser, der sandsynligvis giver en drivkraft for elevation af de neurale folder

Abstract

Centralnervesystemet er afledt af den neurale plade, der gennemgår en række komplekse morfogenetiske bevægelser resulterer i dannelse af neuralrøret i en proces kendt som neurulation. Under neurulation bliver morfogenese af mesenkymet der ligger til grund for neurale plade menes at drive neural fold elevation. Den kraniale mesenkym består af den paraksiale mesoderm og crista neuralis celler. Cellerne af den kraniale mesenkym danner en pourous meshwork sammensat af stjerneformige formede celler og sammenblanding ekstracellulær matrix (ECM) tråde, der understøtter de neurale folder. Under neurulation undergår kraniel mesenkym stereotype rearrangementer resulterer i sin ekspansion og disse bevægelser menes at tilvejebringe en drivkraft for neural fold elevation. Forbliver dog de veje og cellulære adfærd, der driver kraniel mesenkym morfogenese dårligt undersøgt. Interaktioner mellem ECM og cellerne i de kraniale mesenchym ligge til grund THESe celle adfærd. Her beskriver vi en simpel ex vivo eksplantat assay udviklet til at karakterisere adfærd af disse celler. Dette assay kan ændres til farmakologiske manipulationer at dissekere signalveje involveret og levende billeddannende analyse for yderligere at karakterisere adfærden af ​​disse celler. Vi præsenterer et repræsentativt forsøg viser anvendeligheden af ​​dette assay til at karakterisere de vandrende egenskaber af den kraniale mesenkym på forskellige ECM-bestanddele.

Introduction

Neuralrøret lukning i skallepartiet forekommer mellem fosterdag 8,5 (E8.5) og 9,5 i museembryo. Manglende korrekt lukke neuralrøret i hovedet resulterer i anencephalitis, et fælles strukturelt misdannelse hos mennesker og er uforenelig med livet. De kræfter, der driver cephalic neuralrøret lukning frembringes fra både nervevæv selv og det omgivende epidermis og mesenkym ^3. Især udvidelse af kraniale mesenkym menes at være afgørende for elevation af det kraniale neurale folder ^1,2. Den kraniale mesenkym er rig på ECM-proteiner især glycosylerede proteiner, såsom heparin sulfat proteoglycaner, chondroitin-sulfater og hyaluronat ^4-8.

Til forskel i kyllingefoster hvor neural crest-celler emigrere fra den dorsale neuralrøret efter neuralrøret lukning, migrerer det crista neuralis i museembryo på samme tid, at de neurale folder begynder at rise (efter 5 somit fase). Således under neurulation i museembryo, er den kraniale mesenkym bestående af celler afledt fra crista neuralis og paraksiale mesoderm. Neural våbenskjold og akseparallelle mesoderm populationer induceres på forskellige tidspunkter i udviklingen, lokaliseret i forskellige positioner i embryoet og udvikle sig til forskellige strukturer ^9,10. Den paraksiale mesoderm stammer fra primitivstriberne og migrerer til det forreste område af embryonet til grund for den formodede neurale plade. Den crista neuralis induceres ved forbindelsen mellem den neurale plade og epidermal ectoderm, undergår en epiteloverflade med mesenkym overgang og delaminerer lige før neurale fordoblet stigning i gnaver embryo. Neuralkam celler migrerer langs stereotype stier i subectodermal paraksial mesoderm til brankiebue, frontonasal og periokulær mesenchym. Den paraksiale mesoderm vil bidrage til nogle af knoglerne i kraniet hvælving og muskler i ansigtet, og at the neuralkam vil bidrage til andre knogler i kraniet og ansigtet i tillæg til kranienerver ^9-11. Den paraksiale mesoderm og crista neuralis slægter kan være differentielt mærket med Mesp1-cre og Wnt1-Cre transgene muselinjer, henholdsvis ^9.

Den væsentlige rolle kraniale mesenkym i neuralrøret lukning er blevet udledt fra forsøg, hvor behandling af gnavere embryoner med ECM forstyrre midler, såsom hyaluronidase, chondroitinase ABC, heparitinase eller Diazo-oxo-norleucin (DON) under neurulation nedsat neuralrøret lukning ^{7, 12-14.} I disse eksperimenter viste histologisk analyse af statiske sektioner efter neurulation forbundet dysmorphogeneis af den kraniale mesenkym ^7,12-14. Men da den teratogene agent havde adgang til flere væv, er det stadig skal bestemmes, hvis den kranielle mesenkym er virkelig målvævet. Til støtte for den konklusion, at dette væver afgørende for neurulation, den kraniale mesenkym forekommer unormalt ved histologiske analyser i nogle mus mutanter med exencephali ^15-17. Stadig i de fleste tilfælde er virkningen af ​​mutationen på den cellulære opførsel kraniale mesenkym ikke blevet behandlet.

Vi har udtænkt en ex vivo explant assay til direkte undersøgelse af følge af genetisk mutation eller farmakologisk manipulation på adfærden hos kraniale mesenchym-celler ^15. Dette assay svarer til publiceret af Tzahor et al 2003 få adgang til differentieringspotentiale af den kraniale mesenkym der ligger til grund for rhombomeres ¹⁸ bortset vi har modificerede eksplantatet dissektion for at studere den migrerende egenskaber mere anteriore populationer af kranial mesenkym der ligger bag den forreste neurale plade. Vores fremgangsmåde er også en ændring af eksplantations assays udføres i kyllingefoster at analysere vandrende adfærd crista neuralis med key forskelle. Tidligere forberedelser er eksplanteret den neurale kam eller den mere posterior paraksiale mesoderm ^19,20. Desuden skal der ved neural fold elevation i kyllingefoster har crista neuralis endnu udvandrede fra den dorsale neuralrøret og dermed eksplantater taget af den forreste akseparallelle mesoderm vil ikke indeholde crista neuralis celler. I vores assay craniale mesenchym eksplantater bestående af akseparallelle mesoderm, crista neuralis og overflade ektoderm fremstillet og udpladet på et substrat. Eksperimentel manipulation, herunder isolering af eksplantater fra genetiske mutanter, udpladning eksplantater på forskellige ECM eller farmakologiske behandlinger kan udføres. Celler vandrer fra eksplantatet og afstanden, antal og adfærd kan analyseres og sammenlignes mellem behandlingsgrupperne. Desuden er denne forberedelse kan ændres til analyser af cellulær migration ved levende billeddannelse teknikker. Efter migration eksperimentet, kan eksplantater fastsættes og underkastes immunhistokemiske analyser pelsther belyse virkningen af ​​behandlinger. I det hele taget, er den protokol, der præsenteres her en simpel ex vivo assay for at undersøge opførslen af den kraniale mesenkym. Som et repræsentativt eksperiment, benytter vi denne analyse til at undersøge migration af kranie mesenkym på forskellige ekstracellulære substrater.

Protocol

1. Fremstilling af ECM Coated dyrkningsskåle eller dækglas

1. Forbered ECM stamopløsning ved at opløse ECM substrat i PBS (Dulbeccos phosphat-bufret saltvand, Invitrogen, # 14040-133). Der filtreres under anvendelse af en 0,2 mm sprøjtefilter (VWR, # 28145-495) og fryses i alikvoter ved -80 ° C.
2. Fortyndet ECM stamopløsning i PBS til den ønskede koncentration. For MaxGel, fortyndes i DMEM (Dulbeccos modificerede Eagle-medium, Invitrogen, # 11995-065).
3. Hvis immunfluorescens vil blive udført, sterilisere 12 mm cirkulære dækglas (VWR, # 89015-724) ved dypning i ethanol og lad det lufttørre. Dette bør ske i det sterile laminar hætte. Hvis immunfluorescens ikke vil blive udført gå til trin 1,5.
4. Sted steriliseres dækglas i hver brønd i en plade med 24 brønde (Corning, # 3526).
5. Tilsæt 0,5 ml fortyndet substratopløsning til hver brønd af 24-brønds plade og inkuber ved stuetemperatur i 3 timer.
6. Aspirer fra ECM opløsningen og vask three gange i PBS.
7. Aspirere off PBS og anvendes straks eller indpakket i parafilm og opbevaret ved 4 ° C i op til 2 uger.

2. Fremstilling af Dissektionsværktøj

Sylgard plader med tilsat trækul fremstilles pr fremstillingen protokol. Den resistente sort baggrund af disse plader understøtter indkredse embryoet og farven giver god kontrast, som letter visualisering af gennemskinnelige embryo.

1. Til fremstilling af plader vejer direkte ind i en tri-pour bæger på en balance 150 g Part Et flydende 15 g del B og 1 g trækul pulver (World Precision Instruments, # SYLG184). Bland sammen ved hjælp af en træ ispind pind eller tungen depressor. Hæld i glas eller plast 100 cm retter. Brug en lille butan fakkel blev afholdt omkring 10 til 12 inches over retterne at brænde eventuelle bobler. Placer låg på plader og lad sidde i mindst 24 timer for at indstille.
2. Til fremstilling Dissektionsværktøj indsætte en Minutien pin (0,1 mm diameter) i en tap holder (Fin videnskabelige værktøjer, # 26002-10 og # 26018-17, henholdsvis) alternativt 26 gauge nåle (BD, # 309597) bøjet i en ret vinkel ved hjælp af pincet kan anvendes som dissekere instrumenter. Skærpet Student Dumont # 5 Tang (Fine Science Tools, # 91.150-20) ved hjælp af en slibesten (Fin videnskabelige redskaber, # 29.008-22).
3. Steriliser alle Dissektionsværktøj med 70% ethanol før brug.

3. Indsamling af Embryoner

1. Aflive den tidsindstillede gravid mus på 8,5 dage efter coitum i henhold til brug af dyr udvalgets bestemmelser og fjerne livmoderen.
2. Sted uterus i en plast Petri-skål med sterilt PBS.
3. Vask uterus en gang med sterilt PBS.
4. Under en dissektion mikroskop fjernes forsigtigt embryo fra deciduas ved hjælp af en pincet eller lignende.
5. Fjern extraembryonic membraner og spare op til genotypebestemmelse hvis det er nødvendigt.
6. Stage embryo ved at tælle somitter. De ideelle trin at eksplantater at analysere cellulær behavior under neural fold elevation ville være mellem de 6 og 10 somit stadier, når de neurale folder er lige begyndt at ophøje og før den store morfogenese af den kranielle mesenkym finder sted.
7. Vask embryo i PBS. Sted i en sort Sylgard plade med DMEM, der indeholder ingen phenolrødt (Invitrogen, # 21.063-029). Fjern de extraembryonic membraner og spare op til genotypebestemmelse hvis det er nødvendigt.

4. Fremstilling af Eksplantater

1. Koncentrere mikroskop ved den størst mulige forstørrelse over hovedet området af embryoet.
2. Lav udskæringer med en dissektion nål i hver hånd. Brug en nål til at holde vævet på plads, og den anden til at foretage nedskæringer.
3. Skær hovedet af embryoet anterior til rhombomeres.
4. Skær langs midterlinien at gennemskære hovedet i to lige store halvdele.
5. Skær omkring de ydre kanten af ​​hovedet og midterlinjen. Disse nedskæringer vil fjerne premigratory kam og overflade ektoderm ved den ydre grænse ogDen prechordal pladen ved midterlinjen. Den resterende væv bliver eksplantatet og vil indeholde de vandrende craniale neuralkam, akseparallelle mesoderm og overflade ektoderm.
6. Som væv skæres, fjernes dissekeret rester fra skålen ved anvendelse af en steril Pasteur-pipette. Dette forhindrer sammenblanding af eksplantatet med det dissekerede debris.
7. Vask forsigtigt eksplantatet ved pipettering op og ned med en 20 pi pipettespids og Pipetman. Dette vil fjerne løst bundne celler og forhindre takkede kanter på eksplantaterne.
8. Omhyggeligt afhente hvert eksplantat i cirka 10 pi af væske under anvendelse af en 20 pi pipettespids og Pipetman og sted i midten af ​​det overtrukne kulturbrønd.
9. Der tilsættes 20 ul kulturmedie suppleret med 15% FBS for at dække eksplantatet.
10. Den anbringes i en befugtet vævskultur-inkubator _(5% CO2, 37 ° C) i 1-2 timer for at tillade eksplantatet at fastgøre bunden af skålen. Vis med mellemrum, så eksplantatet ikke tørrerud.
11. Når eksplantatet er bundet, tilsættes forsigtigt til hver brønd 250 ul DMEM suppleret med 10% FBS, der er blevet opvarmet til 37 ° C i vandbad. Når eksplantater har vedhæftet de ikke vil bevæge sig, når pladen forsigtigt rystet under mikroskop.
12. Retur parabol til vævsdyrkningsinkubator.
13. Efter 24 timer vil eksplantaterne være solidt fastgjort og celler vil begynde at emigrere. På dette tidspunkt farmakologiske midler kan tilsættes til mediet.
14. 48 timer efter udpladning, vil cellerne er migreret fra eksplantaterne. Den migrerede afstand kan visualiseres og afbildet. Vi typisk stoppe kulturen på dette punkt siden eksplantater begynder at vise tegn på nedsat levedygtighed med længere inkubationer. En vigtig plet såsom acridin orange eller trypanblåt kan også anvendes til at kontrollere levedygtighed eksplantatet.
15. På dette tidspunkt billeder kan erhverves at dokumentere afstand og antallet af celler, der vandrer fra eksplantatet. Alternativt blev hvis eksplantater udpladet på dækglas,De kan være faste og immunohistokemiske analyser udført for at visualisere proteiner af interesse.

Kritiske trin i protokollen

1. Skær eksplantater af omtrent samme størrelse.
2. Ryd alle dissektion vragrester fra dissekere plade som du dissekere at undgå forvirrende snavs med den ønskede eksplanterede væv.
3. Når plating eksplantater i brønde eller på dækglas være sikker på at placere dråbe af medier med eksplantat i centrum af godt.
4. Tillad eksplanteres tilstrækkelig tid til at vedhæfte før oversvømme godt med medierne.
5. Behandling betingelser bør være standardiseret for hver test substrat, der anvendes og farmakologiske middel.
6. To eksplantater kan foretages fra hver embryo (en fra venstre og fra højre af neuralrøret).
7. Ved testning migrationen af ​​celler fra mutante muselinjer under forskellige forsøgsbetingelser, sætte en mutant eksplantat i kontrolgruppen og den anden i den behandlede gruppe.

Fejlfinding

1. Hvis eksplantater ikke vedhæfte, øge den tildelte tid til fastgørelse. Det er vores erfaring, gør omkring halvdelen af ​​de eksplantaterne ikke vedhæfte og større eksplantater klæbe mere effektivt.
2. Hvis eksplantater tillægger periferien af ​​godt de vil være svært at image. Vær sikker på at placere eksplantater i midten af ​​brønden.
3. Ideelt set eksplantater vil være omtrent samme størrelse. Imidlertid kan forskelle i eksplantat størrelse korrigeres for ved hjælp af diameteren af ​​de eksplantater som en korrektionsfaktor ved quanitating vandringer af celler fra eksplantater.
4. Hvis kontaminering forekommer være sikker sterile arbejdsforhold bliver brugt. Alle værktøjer og bordplader skal steriliseres med 70% ethanol. Pipetter og Petriskåle bør være ny og steril.
5. Hvis eksplantater bliver tabt under dissektion, periodisk fjerne snavs at undgå at miste eksplantation.
6. Mastering dissektion er tidskrævende og kræver øvelse. Optimal forstørrelse, skarp dissektion værktøjer og nåle hjælp.

Representative Results

Udseendet af celler migrerer fra kraniale mesenchym eksplantater er vist i figur 2. Vi testede migration på forskellige ECM-substrater, som er til stede i den kraniale mesenkym under neurulation herunder Fibronectin (100 mg / ml, Sigma # F1141), laminin (100 mg / ml, Sigma # L2020), MaxGel ECM (1:500 fortynding i DMEM , Sigma # E0282) og hyaluronsyre (1 mg / ml, Sigma, # 53747). Celler ikke migrere fra eksplantatet, når der ikke ECM er til stede (data ikke vist) og alle substrater testet understøttet migration af cellerne. Både formen og størrelsen af ​​cellerne, der vandrer fra eksplantaterne afhænger af substratet. Det forventes som tidligere undersøgelser viser, at de mekaniske kræfter, der genereres ved interaktion af celler med forskellig ECM påvirker både form og vandrende egenskaber af celler ^21.

Figur 1. Fremstilling af eksplantater. (A) At forberede eksplantater, der E8.5 embryoer dissekeret fra deciduas og extraembryonic væv. (B) Embryo hovederne dissekeret fra kroppen anterior til rhombomeres. Eksplantater fremstilles ved fjernelse af væv fra midterlinien, og de ydre kanter af hovedet for at fjerne prechordal plade ved midterlinjen og premigratory crista neuralis og overfladen ektoderm ved grænsen hhv. (C) Eksplantater fremstilles ved at bortskære væv fra midterlinjen og ydre kanter af hovedet for at fjerne prechordal plade ved midterlinjen og premigratory crista neuralis og overfladen ektoderm ved grænserne. (D) Eksplantater anbringes i et lille volumen af ​​medier på ECM coatede skåle / dækglas og får lov at vedhæfte før tilsætningen af ​​flere medier.

Figur 2. Migration af kraniale mesenchym-celler fra eksplantater udpladet på forskellige substrater. Eksplantater blev udpladet på fibronectin, laminin, MaxGel ECM eller hyaluronsyre og fotograferet efter 48 timer i kultur. Size bar = 200 mm.

Discussion

Den anvendte metode her giver et stærkt analyse for at undersøge opførslen af ​​kranie mesenchym celler. Ud over de statiske analyser præsenteres her, imaging eksperimenter lever i lyse område eller i kombination med ekspression af GFP-mærkede proteiner kan anvendes til at undersøge adfærd af celler i realtid, når de trækker fra eksplantatet. For levende billeddannende eksperimenter, kan eksplantater mærkes med Dil eller at differentiere migration af crista neuralis fra paraksiale mesoderm, ROSA-YFP, Mesp1-cre eller ROSA-YFP, Wnt1-cre eller andre transgene linier kan anvendes. Kraniale mesenkym-ECM interaktioner kan også undersøges under anvendelse af dette eksplantat assay. Her vi plade eksplantater på forskellige ECM-substrater, som er til stede i den kraniale mesenkym at vise, at cellerne migrerer på disse i forskellig grad, og at ECM påvirker cellernes morfologi. Endvidere kan eksplantater være indlejret i en tredimensional matrix til at få adgang til adfærd af cells i denne sammenhæng. Denne eksplantat assay kan ændres til analyse af effekten af ​​genetiske og farmakologiske manipulationer på kranienerver mesenchym adfærd at analysere interne og eksterne tidskoder, der kan regulere og ændre migration. For eksempel anvendte vi dette assay i vores undersøgelser at skelne rollen af overskydende Hsp90 sekretion i den unormale cellulære adfærd i Hectd1 mutant kraniel mesenkym ^15. I disse eksperimenter behandledes vi eksplantater med anti-Hsp90-antistof, Hsp90 protein, geldanamycin og DMA (dimethyl amelioride) for at blokere sekretionen af Hsp90 at vise, at unormal opførsel Hectd1 mutantceller skyldes overskydende ekstracellulær Hsp90 ^15. Lignende fremgangsmåder kan anvendes til farmakologisk dissekere flere veje underliggende normalt og unormalt morfogenese af den kraniale mesenkym. Når assayet er udført, kan eksplantater og migrerende celler analyseres ved en række metoder. For eksempel immunohistokemiske analyser cen anvendes til at undersøge lokalisering af proteiner kritiske til celle bevægelser. Transkriptomet analyser kan også anvendes til at bestemme, hvordan behandlingerne påvirker genekspression.

En væsentlig begrænsning ved denne teknik er, at den ikke model adfærd i tre dimensioner, som de ville forekomme in vivo. Ændring af protokollen, hvor eksplantater er indlejret i en tre-dimensionel matrix (f.eks matrigel) sammen med ekspression af fluorescerende protein-mærkede cellulære rum kunne anvendes nødvendige for at løse dette problem. Selv om disse ændringer blev udført, ville yderligere forsøg for at korrelere adfærd ses i denne ex vivo-assay med de in vivo være nødvendig. Andre begrænsninger medregnet det store antal af embryoner, der er nødvendige for at generere et tilstrækkeligt antal til at generere statisk signifikante data. Vigtigst er det, dissektion er relativt enkel, det kræver øvelse at mestre.