Summary
En metod för att spåra synaptiskt anslutna nervceller beskrivs. Vi använder TVA specificitet en uppströms cell att söka om en cellpopulation av intresse får synaptisk input från genetiskt definierade celltyper.
Abstract
Klassiska metoder för att studera neuronala kretsar är ganska låg genomströmning. Transsynaptisk virus, i synnerhet pseudorabies (PRV) och rabies virus (RABV), och på senare vesikulär stomatit virus (VSV), för att studera kretsar, blir alltmer populärt. Dessa högre genomströmning metoder använder virus som sänder mellan nervceller i antingen anterograd eller retrograd riktning.
Nyligen har en modifierad RABV för monosynaptiska retrograd spårning utvecklats. (Figur 1A). I denna metod är glykoprotein (G)-genen bort från det virala genomet, och resupplied endast i riktade neuroner. Infektion specificitet uppnås genom att ersätta en chimär G, bestående av den extracellulära domänen av ASLV-Ett glykoprotein och den cytoplasmatiska domänen av RABV-G (A / RG), för den normala RABV-G 1. Denna chimära G infekterar specifikt celler som uttrycker TVA receptorn 1. Den gen som kodar TVA kan varit delivered genom olika metoder 2-8. Efter RABV-G infektion av en TVA-uttryckande neuron kan RABV överför till andra, synaptiskt anslutna nervceller i en retrograd riktning av naturen för sin egen G som var tillsammans levereras med TVA-receptorn. Denna teknik märker ett relativt stort antal ingångar (5-10%) 2 på en definierad celltyp, vilket ger ett urval av alla ingångar på en definierad förrätt celltyp.
Vi har ändrats nyligen denna teknik för att använda VSV som transsynaptisk spårämne 9. VSV har flera fördelar, däribland snabbheten av genuttryck. Här har vi detaljerat ett nytt viralt system för spårning med VSV användbart för sondering microcircuitry med ökad upplösning. Även om de ursprungliga publicerade strategier för Wickersham et al. 4 och Beier et al. 9 medger märkning av alla nervceller som projekt på initialt infekterade-TVA-uttryckande-celler, här VSV var konstruerad för att överföra endast till TVA-uttryckande celler (figur 1B). Viruset först pseudotypade med RABV-G för att tillåta infektion av nervceller nedströms TVA-uttryckande neuroner. Efter infektera denna första population av celler, släpptes viruset kan bara infektera TVA-uttryckande celler. Eftersom transsynaptisk viral spridning är begränsad till TVA-uttryckande celler, närvaro eller frånvaro av anslutning från definierade celltyper kan utforskas med hög upplösning. En experimentell flödesschema av dessa experiment visas i figur 2. Här visar vi en modell krets som inriktning, selektivitet i mus näthinnan. Vi undersöker uppkopplingen av starburst amacrine celler (SAC) till näthinneganglieceller (RGC).
Protocol
1. Göra Virus från cDNA: Återvinning av VSV från cDNA med Vaccinia-T7-systemet 10
- En dag före experimentet dela BsrT7 celler i 60 mm skål innehållande DMEM + 10% FBS. Seed 2E6 celler per skål. BsrT7 celler är härledda från BHK21, eller babyhamsternjurceller, celler.
- Varm PBS med 1 mM magnesiumklorid och 1 mM kalcium till 37 ° C.
- Skaffa en liten alikvot vTF7-3, ett vacciniavirus som uttrycker T7-polymeras, och tina till rumstemperatur. vTF7-3 är en smittsam vacciniavirus som uttrycker T7-polymeras 11, och bör endast användas i skyddsnivå 2 inneslutning. Detta expressionssystem används för att generera maximala nivåer av de önskade transkripten från plasmider transfekterade i steg 1,9. Vortex-virus i 30 sekunder vid max hastighet. Sonikera i en bordsskiva sonikator under 2 min i vattenbad vid rumstemperatur. Vortexa igen under 30 sek för att bryta upp klumpar virala.
- Ta ut mediet från BSRT7 cellerna.
- Lägg 11,7 pl vTF7-3till 600 | il PBS med magnesium och kalcium och tillsätt blandningen på cellerna.
- Flytta plattorna till en 34 ° C inkubator med 5% CO 2. Rock plattor försiktigt en gång var 10: e min.
- Efter 45 minuter har förflutit, börjar transfektion. Tillsätt 20 ul lipofektamin 2.000 till 1 ml DMEM och blanda. Vänta 5 minuter.
- Lägg 5,25 pg pN, 2,3 pg pP, 1,2 pg pl, 1 pg pCAG RABV-G och 6 pg VSV genomiskt cDNA till 500 pl DMEM. pN, pP och pl är plasmider driver expression av VSV virala gener under T7-promotom 10, med de belopp som fastställts empiriskt för optimal räddning av viruset.
- Kombinera båda rören och blanda. Vänta 15 min vid rumstemperatur.
- Ta PBS och tvätta plattorna en gång med 1,5 ml DMEM.
- Aspirera skölj medier. Lägg transfektion blandning till platta. Flytta plattorna i 34 ° C inkubator.
- Vänta 5 timmar och ta sedan bort media.
- Ändra media till 4 ml DMEM + 2% FBS + 1x penicillin-streptomycin + 10 mM HEPES pH 7,4. Tillsatsen av Penicillin-streptomycin, för att förhindra kontaminering, och HEPES, för att upprätthålla pH i medierna, är mycket viktiga. FBS innehållet kan släppas till 2%, eftersom cellerna kommer att förstöras inom några dagar av viruset och således behöver inte 10% FBS.
- Placera plåtar i 34 ° C inkubator för 48-72 timmar.
- Samla medier vid 3 och 6 dagar efter transfektion, och omedelbart sprutfilter genom ett 0,20 pm filter. Denna storlek filtret tar bort den vacciniavirus, men inte VSV.
- Eftersom vi vill leverera RABV-G till det virala höljet, och genomet inte kodar för RABV-G-genen, måste den kontinuerligt tillhandahållas i träns. För att göra detta, göra en separat platta med 293T TVA800 (TVA800) celler. Dessa är celler som konstitutivt uttrycker TVA receptom, vilket medger ENVA-medierad virusinfektion 12. Vid 80% konfluens, byta media till DMEM enbart, sedan transfektera cellerna med 5 pg av plasmiden som kodar för G-protein (dvs. pCAG RABV-G) per platta. Vi använder PE-Jag transfektionsreagens, en polykatjonisk polymer, som är mycket billigare än jämförbara lipidbaserade metoder. Emellertid kan lipofektamin också användas effektivt för detta ändamål. Den optimala PEI: DNA-förhållandet måste bestämmas empiriskt. Gör detta i ett separat experiment med en fluorescerande reporter, dvs pCAG GFP. Vi använder 10 il PEI: 4 pg DNA.
- Applicera supernatanten från steg 16 på transfekterade platta TVA800 celler.
- Observera denna platta dagen för tecken på fluorescens av viralt uttryckt fluoroforen. Viral fluorescens först observeras som en enda cell, och gradvis sprider sig över tiden (dvs. figur 3). Viruset bör spridas inom några timmar.
2. Passage och koncentration av VSV
- Split TVA800 celler i medium innehållande DMEM + 10% FBS så att du kommer att ha fyra 10-cm plattor på ~ 80% konfluens nästa dag. 293T-baserade celler fungerar bra på grund av sin höga transfectability, och användningen av TVA-uttryckande celler ökar den hastighet med vilken cellerna i skålen blir infekterade. Andra mycket transfekterbara cellinjer kan tjäna syftet också.
- Vid 80% konfluens, ändra media till DMEM bara, då transfektera cellerna med 5 pg av plasmid som kodar för G-protein som du vill använda (dvs. pCAG RABV-G) per platta. Vi använder PEI, men Fugene / Lipofectamine arbete.
- Vänta ett dygn efter transfektion för glykoprotein uttryck / yta ackumulering. Ändra media (5 ml / platta) DMEM + 10% FBS, sedan infektera med rVSV (A / RG)-virus vid en multiplicitet av infektion (MOI) av 0,01 <x <0,1.
- Kontrollera mängden av infektion 24 timmar senare. Du bör se infekterade celler (identifieras av GFP fluorescens), vissa med närliggande fläckar av infekterade celler (dvs. figur 3). Vanligtvis är det bara värt att samla in supernatanten om du ser> 50% av celler infekterade, annars virustitrar obtained från koncentration kommer att vara suboptimalt.
- Om> 50%, samla 5 ml medium / platta, och ersätt med 5 ml färskt medium. Om för få celler är infekterade, vänta på en annan 12-24 timmar, och kontrollera igen. Frys de uppsamlade supernatanterna vid -80 ° C.
- Samla varje 24 timme därefter under 3 dagar, under totalt 4 dagar.
- Sammantaget, om du började med 4 plattor, bör du ha 20 ml media från varje dag - så 80 ml totalt, eller 2 tuber ultracentrifug värt supernatanten. Tina supernatanterna vid 37 ° C och filtrera över 0,45 um filter på is. Alikvotera 36 ml virus i Beckman centrifugrör.
- Koncentrera supernatanten (21.000 K i en SW28-rotor (= 80 tusen xg) under 90 minuter) vid 4 ° C. Dekantera supernatanten i en bägare innehållande 10% blekmedel, och medan röret är inverterad, en sugapparat för att avlägsna så mycket material från sidan av röret som möjligt.
- Medan täckt. skaka de virala rören vid 4 ° C under 1 timme. En standard skakanordning vid About 120 rpm är tillräcklig.
- Försiktigt triturera pelleten i de återstående mediet genom att försiktigt pipettera upp och ned 30 gånger. Var noga med att inte införa luftbubblor. Den återstående mediavolymen bör vara ca 30 ^. Alikvotera denna volym i flera rör för att förhindra flera frys-tö cykler för någon särskild materiel, eftersom detta kan resultera i en minskning av virustiter. Dessa alikvoter kan frysas vid -80 ° C.
- Titrera viruset. Titrering vid omkring 2 dagar efter infektion är optimal. Initial infektion kan observeras i några timmar, men du får en underrepresentation av titer om du väntar bara 1 dag. För att erhålla den virala titern, utför en begränsande utspädning experiment av koncentrerat virus på lämplig cellinje (293T-celler fungerar bra) i en 24-brunnars platta, utspädning av viruset 10-faldigt från 1 till 1: 1.000.000. Titrarna vi får är typiskt i området av 10 8 -10 10 fokus-bildande enheter (ffu) / ml.
3. Viross Injektion
- Vi använder möss, typiskt mellan 6-10 veckors ålder, för dessa experiment. Varje ålder varefter kretsar är etablerad skulle räcka. Vi kommer att välja överföringen från näthinneganglieceller (RGC) till starburst amacrine celler (SAC) som ett exempel. Detta experiment, såsom diagramform i figur 2, kräver en trippel transgent djur och endast en enda injektion av virus. (Alla tid som visas förfaranden godkändes av IACUC vid Harvard Medical School, och var i överensstämmelse med institutionella riktlinjer).
- Först rätt djuren måste genereras. Målet är att ha TVA uttrycks i celltyp som man önskar kartlägga in, medelst ett virus (dvs. adenoassocierade virus, AAV), eller av en transgen allel. Celltypen specificiteten erhålles vanligen genom Cre-uttryck. Här korsade vi också i ett villkorligt uttryck TVA allel 7 till en kolinacetyltransferas (ChAT)-Cre-allelen 13, så att TVA uttrycksi alla celler med Cre uttryck historia (de SAC). Vi korsade också en villkorligt uttryck tdTomato allelen (R26TdT) för visualisering av TVA-uttryckande celler.
- Koordinaterna för injiceringsstället måste identifieras. Dessa koordinater av intresse kan hittas i en hjärna atlas, dvs Franklin och Paxinos mushjärna atlas 14. Dessa koordinater måste noteras i förhållande till en given landmärke på musen skallen. Vi använder bregma, men alla koordinatsystemet är tillräcklig.
- Förbered stereotaxisk apparat. Slå på microinjector kontrollenheten, och flytta kolven och elektrodhållaren på plats. Sedan tillbaka-fylla injektionsnålen med mineralolja för att tillhandahålla ett gränssnitt med viruset. Stick in nålen sedan på kolven och se till att inga luftbubblor finns kvar i nålen.
- Tina viruset, och placera på is för att förhindra en minskning i virustiter. Ställ microinjector till "dra" och flytta röret av virus så att det är contacting kapillären på microinjector. Dra upp erforderlig mängd rVSV (A / RG) pseudotypade med RABV-G för experimentet.
- Djuren ges en preoperativ dos av buprenorfin (0,05-0,1 mg / kg) innan operationen påbörjas. För bedövande djuret, antingen isofluran inhalation eller en intraperitoneal injektion av en ketamin (40-80 mg / kg) och xylazin (5-10 mg / kg) blandningen är tillräcklig. Val av narkosmedel är beroende på användaren. En tå nypa utförs sedan för att se till att djuren är fullt bedövad, om djuret inte svarar kan du fortsätta med proceduren. Var noga med att få rätt tillstånd innan du använder dessa läkemedel.
- Djuren placerades på en uppvärmd dyna, som är stödd på en rörlig stativ för positionering av musen. Djuret förblir där under hela den kirurgiska proceduren. Applicera ögonsalva för att förhindra uttorkning av hornhinnan medan djuret sövs.
- Musens huvud måste sedan stabiliseras i stereotaxiska enApparater. Använd örat staplarna på stereotaxisk apparat för att säkerställa att huvudet är grundligt säkras, så att huvudet är parallellt med marken, och roterar inte i sidled. När detta är klar, justera bettet bar att hjälpa till att stabilisera huvudet.
- Djurets päls rakades i området för snittet på toppen av huvudet. Detta område sedan tvättas tre gånger med etanol, följt av tre gånger med jod. Ett snitt görs sedan i huden med en skalpell, avslöjar skallen.
- När musen och injektion inställning är beredda, behöver bregma ska placeras. Detta är det område i mitten av huvudet som sagittala och två koronala suturer möts. När detta område är beläget, kan rattarna på stereotaxisk apparat kan användas för att justera microinjector till rätt koordinaterna. Här injicera vi den laterala geniculate kärnan (LGN), med hjälp koordinaterna A / P -2,46 från bregma, L / M 2, D / V 2,75.
- När koordinaterna har ringt in, måste borren monteras.Placera borren i borren, och slå sedan på borren. Ett litet hål borras i området identifierats som injektionsstället. Var mycket försiktig med borren för att inte orsaka skada på hjärnparenkymet. När benet är mycket tunn, blodkärl på dura bli klart. Vid denna punkt, noggrant perforera kanter kraniotomi med en liten (30 gauge) nål och en fin (# 5) pincett för att avlägsna kvarvarande benet.
- Justera kapillären till ett läge strax dorsala av hjärnan yta, där hålet var bara borras. Nålen bör vara tillräckligt skarp för att tränga in i dura mäter med lätthet. Sedan sänka nålen till önskat djup, och börja injektion. Vi injicerar virus vid en hastighet av 100 Nl / min.
- Injektionsproceduren till denna punkt tar ungefär tio minuter. Efter injektion förblir nålen i hjärnan under cirka sju minuter. Detta är avgörande, eftersom den tillåter diffusion av virus från injektionsstället. Snabbt bort nålen bildar InjeInsatser site resulterar i en minskad infektion effektivitet vid injektionsstället, och infektion längs nålen tarmkanalen.
- Nålen är mycket långsamt höjs från injektionsstället, över en spännvidd på omkring två minuter. Detta är återigen avsett för att minska infektion längs nålen tarmkanalen.
- Efter uttagningen, huden sutureras sedan. Djuren följs kontinuerligt tills de återhämta sig från anestesi. Buprenorfin (0,05-0,1 mg / kg) administreras var 12 h under 2 dagar.
4. Skörd Mjukpapper / vävnadspreparat
- För skörd vävnaden av intresse, beror den optimala tiden på målen för försöket. Generellt kan VSV transsynaptisk spridning först observeras med mindre än 24 timmar efter injektionen. Dock kommer väntar längre tider resultera i mer spridning.
- Att skörda näthinnan är djuren för första gången avlivas med inandning av koldioxid och halsdislokation utförs. Ögongloben avlägsnas sedan, och placerades i ett rör conlande 4% formaldehyd i PBS under 1 timme vid rumstemperatur.
- Ögongloben placeras sedan i en Petri-skål med PBS. Näthinnan därefter dissekerades bort från andra vävnader.
- För hela montera analys är de retinae kapas så att ligga platt, placeras på en glasskiva, sedan monteras med förlänga guld montering media och täckt med en noll-tjocklek täckglas. Silikon distanser placeras mellan bild och täckglaset för att minimera tryckkrafter på näthinnan. För avsnitt analys är näthinnan placeras i 30% sackaros i PBS tills näthinnan submerges. Den placeras därefter i en blandning av 50% OCT och 50% 30% sackaroslösning under 3 timmar. Den blinkar sedan fryses, och hölls vid -80 ° C tills den ska skära.
5. Representativa resultat
Viruset som räddas från cDNA skulle kunna infektera TVA800 celler, men inte 293T-celler (figur 3). Levererar RABV-G tillåter infektion av flera celler types inklusive 293T. Eftersom A / RG genomet kodas i genomet, spridda bland celler sker vid en mycket högre hastighet i TVA-uttryckande celler.
När viruset är koncentrerade, typiskt titrar intervallet mellan 10 8 ffu / ml och 10 10 ffu / ml. Dessa titrar är lämpliga för användning in vivo.
Under LGN injektion i mus, skiljer vi inte dorsal LGN (dLGN) från ventrala LGN (vLGN), som båda smittade vanligtvis blir. Därför blir många RGC typer märkta (Figur 4), inklusive de som projektet till vLGN såsom melanopsin RGC (Figur 4D) och ON-DSGCs (Figur 4E), och de som projektet till dLGN, såsom små berså RGC (Figur 4C) och ON-OFF-DSGCs (Figur 4F). Även om mer än en typ av RGC överförda virus till särskilda bevarandeområden, som rapporterats på annat håll (Beier et al., I granskning), här fokuserar vi barapå de väl studerade anslutningar ON-OFF-DSGCs till särskilda bevarandeområden.
När vi injicerar möss av genotypen cTVA (+) / chat-Cre (-), där ingen TVA bör uttryckas, endast RGC märkta (dvs. figur 4). Dessa beror på initiala upptag av RABV-G pseudotypad virus av RGC och inte sprids sker. Inga RGC infekteras från en LGN infektion av rVSV (A / RG) virus inte pseudotypade med RABV-G på grund av en oförmåga hos dessa virioner till tvärgående de långa axonerna av dessa RGC. Emellertid, vid injektion cTVA (+) / ChATCre (+) (och R26TdT (+)) möss i LGN, sker viral spridning, endast till röda celler, vilka uttrycker Cre-reporter (dvs figur 5). Dessa celler också sam-etikett med anti-chat-antikropp, och skiktas endast i två ChAT lameller, bekräftar deras identitet som särskilda bevarandeområden (figurerna 5B ', C). Antalet viralt märkta bevarandeområden per DSGC varierade 1-9.
Figur 1. Vår bakåtsträvande transsynaptisk system för spårning jämfört med den ursprungligen utvecklades metoden. (A) (i) I den metod som utvecklats av Wickersham och kollegor, "starter celler" transfekteras med tre gener: TVA receptorn, som används för att tillåta infektion specifikt av transfekterade celler, den RABV-G, som används för att komplettera RABV, som själv hade G-genen strykas, och en röd fluorescerande protein för att identifiera transfekterade celler. (Ii) En RABV pseudotypade med A / RG-protein infekterar TVA-uttryckande celler, vilket gör dem gul. (Iii) Retrograd transsynaptisk överföring sker till uppströms nervceller. (B) (i) I vår metod, TVA-uttryckande celler definierade genetiskt, och är märkta med en villkorlig röd fluorescerande protein (ii) "starter celler" är de som är infekterade av en VSV kodar A / RG-genen i det virala genomet. Dessa starter celler uttrycker inte TVA-receptorn. (Iii) Retrograd transsynaptisk överföring sker till TVA-uttryckande neuron endast om dessa celler ger synaptisk input på de starter nervceller. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Schematisk av det experimentella förfarandet. (A) Först viruset räddas från cDNA. Det är sedan passerades och pseudotypade med RABV-G och koncentrerades och titrerades. Detta virus injiceras sedan in i hjärnan, där det tillåts att inkubera under den önskade tidsperioden. Efter dettatid, är ögat skördas, och näthinnan dissekeras och analyseras. (B) Schematisk pseudotypning viruset med RABV-G. Detta är nödvändigt för infektion av retinala ganglionceller från en hjärna injektion. Den RABV-G-genen först transfekteras in vävnadskulturceller som uttrycker receptorn TVA. Dessa celler infekteras sedan med rVSV (A / RG)-virus. De frigjorda virionerna kommer att ha RABV-G i virushöljet, men kommer inte att ha genen för RABV-G i det virala genomet. (C) En schematisk bild av musen korsar nödvändig för trippel transgena djur. Villkorliga TVA och tdTomato alleler korsas till en Cre förare av val, så att både TVA och tdTomato uttrycks endast i celler med en Cre-uttryck historia. I det här exemplet använde vi ChAT-Cre. (D) En schematisk av näthinnans infektionen i syfte att spåra DSGC-SAC-kretsar. Chatten celler görs för att uttrycka TVA och tdTomato, som visas i (C). RGC infekteras av en LGN ifection av viruset som producerats i (B). Eftersom viruset uttrycker GFP, kommer dessa RGC vara gröna. Viruset kommer sedan sprida endast TVA-uttryckande ChAT amacrine celler om de är anslutna till den märkta RGC. Dessa celler kommer att vara både rött och grönt eller gult. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Beteende rVSV (A / RG) virus på 293T och TVA800 celler. Dessa celler infekterades med en låg titer rVSV (A / RG) pseudotypade med RABV-G. Viruset sprids mellan TVA-uttryckande celler i några timmar, såsom visas vid 6 timmar efter infektion (HPI), 1 och 2 dagar efter infektion (DPI). Emellertid sprids på 293T-celler, som inte uttrycker TVA receptorn, även om jagt inträffar, händer mycket långsammare. Skala bar = 100 nm.
Figur 4. Representativa infektioner av RGC av icke-TVA uttrycker möss. Djuren injicerades i LGN med rVSV (A / RG)-virus pseudotypade med RABV-G, och vävnad skördades 2 dpi. (A) Sparse (RGC indikeras av gula pilhuvuden) eller (B) täta infektioner kan erhållas, beroende på titern av virus och kvalitet injektion. Många olika typer av RGC kan identifieras utifrån morfologi, inklusive (C) liten berså RGC, (d) typ 1 melanopsin RGC, (e) på-DSGCs, och (F) ON-OFF-DSGCs, bland annat. Skala barer = 50 pm.
Figur 5. RVSV (A / RG) överföring från ON-OFF-DSGCs till SBO följer det förväntade mönstret. (A) ON-OFF-DSGCs (vit pil med grön fyllning) överför viruset till flera SBO (gula pilspetsar). (A '). Alla gröna celler som inte är DSGC sam-etikett med Cre reporter, vilket indikerar att de är TVA-uttryckande särskilda bevarandeområden. (BC) Den DSGC (vit pil med grön fyllning) och SBO (gula pilar) stratifiera i lämpliga ChAT lager av näthinnan inre plexiform lager (IPL). De celler som viruset sänder inkluderar både på och utanför-säckar. Siffror i panelerna B 'och C' indikerar IPL lamellerna. Platsen för DSGC soma endast indikeras av pilen, men visas inte i panelen C för att markera särskilda bevarandeområden. Skala barer = 50 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Använda virus att studera neurala kretsar är en relativt hög genomströmning för analys anslutna neuroner. Men generera både VSV och RABV virioner är inte trivialt. Även om protokollet ovan för att rädda virus från cDNA som är det fortfarande en låg sannolikhet händelse. Nivåerna av var och en av N, P och plasmider L måste finjusteras, och många försök och replikerar behöver göras för att säkerställa viral räddning. Bildandet av ribonukleotiden partikeln innefattar en fullständig VSV-genomet RNA är en låg-sannolikhet händelse, och därför kan ta flera försök. Denna teknik kan behöva tid för optimering, men när den väl är optimerad, rädda virus är mycket lättare.
Analys av virusöverföring från enskilda RGC görs bäst när RGC dendritiska Arbors inte överlappar (dvs. Figur 4A). Mängden virus injicerade och koordinater injektion kan justeras för optimal infektion. Dessutom, than läge injektion kommer att påverka antalet och typer av inmärkta RGC (dvs. överlägsen coUiculus eller superchiasmatic kärna kommer att märka olika antal och typer av RGC än en LGN injektion).
VSV har ett antal fördelar i förhållande till PRV och RABV. Expressionsnivån av VSV är mycket snabb, är synliga inom några timmar 9,15. Detta medger kortare inkubationstider. I detta experiment, var A / RG glykoprotein kodas inom det virala genomet, vilket gör viruset replikationskompetenta. Samtidigt som replikationskompetenta rabiesvirus gör en BL3 skyddsnivå som krävs, för VSV, det är bara BL2. Glykoproteinet kan ha lämnats i träns i RGC genom tidigare infektion av en AAV kodar för A / RG fusionsprotein dvs. Men bygger denna strategi på dubbel infektion och nivåerna av glykoprotein uttryck kan inte vara optimal. När det uttrycks från det virala genomet, är glykoprotein nivåerna finjusteras som ifallet med vildtyp VSV. Utan behov av samtidig infektion, alla märkta RGC har potential för viral transmission. Den stora nackdelen av VSV är dess relativt snabba celltoxicitet. Vi har granskat VSV-infekterade celler genom fysiologi, och noterade att de var fysiologiskt normala med 18 timmar efter infektion, men var för sjuk för att få fysiologiska mätningar av 48 timmar efter infektion. Generellt nervceller ser morfologiskt normala för 2-3 dagar efter infektion, men börjar visa tecken på sjukdom (blåsbildning) kort därefter. Detta är efter den tid under vilken transsynaptisk överföring kan observeras (24 timmar). Men alla transsynaptisk virus, inklusive RABV och PRV, är toxiska för cellerna. Därför är VSV närvarande bäst för en anatomisk märkning verktyg, även om vi är i färd med att göra det bättre lämpad för fysiologiska manipulationer.
VSV är ett särskilt kraftfullt transsynaptisk neuronal spårämne. Av naturen av dess förmåga att acceptera olika g.lycoproteins kan det spåra neuroner i anterograd och retrograd riktningar 9. Här visar vi att det också kan användas för att sondera en annan fråga - om en genetiskt definierade celltyp ingångar på en förrätt cellpopulation. Här visar vi dess användbarhet i näthinnan, men vi har också använt den för att märka genetiskt definierade interneuronal populationer hjärnan med samma framgång. Man kan också modifieras att innehålla en annan glykoprotein, för att tillåta transsynaptisk anterograd överföring till TVA-uttryckande celler. Möjligheten att ytterligare manipulationer ger potential att ytterligare bidra till att analysera mikrokretsar och avkoda komplexa beräkningar av neurala anslutningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka för Sean Whelan för hjälp med att rädda rekombinant VSV varianter och Didem Goz och Ryan Chrenek för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av HHMI (CLC) och # NS068012-01 (KTB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
| vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
| pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
| Media : DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
| Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
| Viral Centrifugation | |||
| Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
| Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Mouse Injection | |||
| Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
| Stereotax | Narishige | SR-5M | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
| Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| Micr–lectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
| Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| Ethanol | Sigma | 493511 | |
| Iodine | Sigma | PVP1 | |
| Surgery and Dissection tools | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Dissection and antibody staining | |||
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Antibodies | |||
| Antibodies | millipore | AB144P | |
| Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
| Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Tissue mounting | |||
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
| Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
|
|||
References
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
- Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
- Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
- Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
- Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
- Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
- Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).
- van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).
