骨転移モデル

Summary

動物モデルは頻繁に骨への癌の転移を研究するために利用されている。このプロトコルでは、骨転移の研究のために腫瘍接種の2つの一般的な方法を説明し、簡単にこれらのモデルを監視し、定量化するために利用される分析のいくつかを説明します。

Abstract

骨転移は、乳癌、前立腺癌、および肺癌を含むいくつかの悪性腫瘍で一般的なものです。一度骨に設立され、腫瘍はかなりの罹患率と死亡率の¹を担当している。このように、骨の腫瘍の確立、成長や活性を制御する分子メカニズムを理解するための重要な必要性がある。 in vivoモデルのいくつかは、これらの事象を研究するために設立され、それぞれが固有の利点と制限事項がありますされています。最も一般的に使用されるモデルは、無胸腺（ヌード）BalbCマウスの動脈血供給に直接腫瘍細胞の心臓内接種を利用しています。この手順は、多くの異なる腫瘍タイプ（PC-3前立腺癌、肺癌、およびマウスの乳腺脂肪体腫瘍を含む）に適用することが可能であるが、本稿で我々は、MDA-MB-231乳癌モデルに焦点を当てます。このモデルでは、我々はもともとサン^{アントニオ}の博士マンディのグループで導出された高度に骨選択的クローンを、利用している時間以来、GFPの発現のためにトランスフェクトされ、私たちのグループ³によって再クローニングさとして。このクローンはosteotropism率が高いと、肺、肝、副腎にはほとんど転移を有する骨転移変種です。心臓内注射は、最も一般的に骨転移²の研究のために使用されていますが、特定の場合にintratibial ⁴または乳房脂肪注入の方が適しています。 、骨に逮捕生き残る、増殖し、癌誘発性骨疾患に発展する腫瘍を確立するために具体的には、癌細胞の能力を転移の後の段階を監視することを目標に、ヒト腫瘍細胞を使用しているとき心臓内注射は、一般的に実行されます。腫瘍が確立された転移性骨疾患にほぼ相関して骨に転移した後にがん細胞と骨の関係に着目した場合Intratibial注射が行われます。塞栓症とエントリにもこれらのモデルを再現するの転移過程の初期段階では、前循環への腫瘍細胞の。骨へのプライマリ·サイトから原発腫瘍の増殖や転移を監視する場合は、次に乳房脂肪の接種は通常、優先ですが、非常に少数の腫瘍細胞株は一貫して、4T1骨優遇クローンで、プライマリサイトから骨に乳腺マウスを転移するでしょう癌、例外^5,6である。

本稿では、このような細部接種の手続きを、ポスト接種分析における重要なステップが強調表示されます。具体的には、細胞培養、心臓とintratibial接種のために腫瘍細胞接種の手続きと同様に、X線、蛍光および組織形態計測分析による毎週のモニタリングに関する簡単な情報が含まれています。

Protocol

1。細胞維持

1. MDA-MB-231の多くが骨転移したサブクローンは骨の植民地化と成長のための変数を持っている傾向が存在しています。我々の実験のために私達はUTHSCA ²で開発されたGFPタグ付きのMDA-MB-231由来のクローンを使用しています。この特定のサブクローンは4週間で犠牲にして、約3週間後の接種で可視溶骨性骨病変を形成することになる。
2. 37℃、10％FBSおよび0.1 mg / mlのペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEMで細胞を維持°5〜8％CO _2の ⁷のC。
3. 1:10希釈80〜90％コンフルエントと再プレートで継代細胞（これは細胞の種類やサイズのプレートによって異なります、T-75のMDA-MB-231細胞では、これは約6×10 ⁵である）、これおよそ72時間です。
4. MDA-MB-231細胞は、多数の偽足と概ね線維芽細胞の外観を維持します。任意の丸めは過密または他の望ましくないストレスの指標であり、このため、避けなければならないin vivoでの転移の可能性に影響を及ぼす可能性があります。
5. 理想的には、細胞を接種（私たちは以下の1週間をお勧めしたり、実験のために十分な細胞を持つまで）の前には簡単にしか培養で維持されるべきであり、丸めまたは細胞増殖率の変化が発生した場合、新しいバイアルを解凍する必要があります。

2。細胞調製

1. 0.15％80〜90％のコンフルエンスで細胞をトリプシン処理トリプシン/ EDTA（PBS中の0.5％ギブコトリプシンEDTA 1:2希釈）。この濃度は、高速剥離（<2分）を可能にし、細胞の凝集が減少します。
2. 直ちに10mlの氷冷DMEMを5分間200×gで15 mlコニカルチューブおよび遠心分離機に10％のFBS、ピペットを含有するプレートから細胞を除去する。
3. 25ミリリットル氷冷PBS（CaおよびMgなし）と数えるの50 mlコニカルチューブでペレットを再懸濁します。
4. 再ペレットに遠心し、1ml当たり10 ^6個の細胞（心臓）で、または氷冷PBSで25万cells/10μL（intratibial）で再懸濁します。テンペラPBSのトゥーレは、注入後の細胞とそれに続く塞栓症の凝集を防止することが重要である。細胞懸濁液は、注射を行いながら、氷の上に残っているべきであり、実行可能で、30分間、国連は、凝集したままになります。必要なプレートの正確な数は、治験責任医師から治験責任医師に異なりますが、我々は一般的に8月10日マウスの間には1、T-75を使用しています。

3。心臓内接種

1. 4〜6週齢の雌（Foxn NU-/ - ：ハーラン）マウスは、これらの実験のために使用され、他の免疫不全マウス（RAG1-/ - 、RAG2 - / - 、SCID、XID、およびなど）のものも出できヒト癌細胞の実験で使用されます。
2. 注入手順による死亡率を減少させる、と撮像法のバックグラウンド蛍光を低減するために注入する前にヌードマウス飼育Teklad 2920xダイエット5-10日である必要があります（食べ物はアルファルファ無料ですので）。
3. のnu / nuマウス以外を使用する場合は、腹側腹部ARで（我々の経験Nairさんでよりよく動作）ナイールを剃るか、または使用することによって毛を取り除く手順を開始する前にEA。
4. または他の好ましい麻酔（我々の経験ではイソフルランが心臓内接種に対して許容最高です）：イソフルラン気化器（2-3 L / minのO ₂ 2.5％ISO）を使用して隔離室でマウスを麻酔。
5. ステンレス製換気フード内麻酔マシンのノーズコーン、一度に1つのマウスを移動します。
6. 上を向いて胸と背中にそれぞれのマウスを置きます。
7. 2回繰り返し、70％エタノール、続いて10％ポビドン/ヨウ素綿棒/溶液と胸を洗ってください。
8. 注射用マークマウスの胸（無菌マーカーを使用したり、注射部位を無菌維持する側に若干マーキング）。我々は、胸骨のマーク位置胸骨切痕とxyphoidプロセスの上部との間の中間にあり、わずかに左に（解剖）を使用します。 300μlの28グラム½インスリン注射器のプランジャとメニスカスの間にスペースを（心臓パルスを見るために重要）を作成するために注射器の中に空気の小さな泡を描き、細胞100μlを描く。
9. 針が直立しておいてください。もう一方の手でピンと張ったマウスの皮膚を押さえながら、針を挿入します。
10. 左心室に挿入が成功し、シリンジ内の血液の明確な明るい赤のパルスになるはずです。この深さでは、慎重に胸腔内の心臓やこぼれた細胞を刺さないように針の重要な動きなく、シリンジのプランジャ（100μlの体積）を踏み込みます。
11. 細胞が注入された後、胸腔への細胞のしたたり減らすために負圧の少量を作成するためにプランジャを少しアップされています。
12. 心臓の内膜を引き裂き、出血を引き起こす可能性があります取り外し、中に針を傾けないように注意しながら直接胸の針を引き抜きます。
13. 出血を減らすために注射部位の上に胸に穏やかな圧力を適用します。
14. ノーズコーンからマウスを取り外し、約1分間の光の圧力を適用し続ける。
15. 完全に詐欺になるまで加熱パッドにマウスを移動scious。
16. マウスが回復した後にスピンしたりけいれんし始めた場合は、可能性の高い原因は塞栓症です。血管抵抗を減少させながら血流量と心拍出量を増加させるためにケタミンの80〜120 mg / kgを腹腔内でマウスを注入します。これは、マウスが血栓に合格するのを助ける必要があります。これが発生した後、それは、細胞が凝集されていることを示しているとして、それは、細胞調製物を変更するのが最善です。我々は、約8匹の後に細胞調製物を変更するか、または30分。

4。 Intratibial

1. Buprenex（0.1 mg / kg）のか、すぐに手続きの前に似たような承認された鎮痛剤をマウスに注入します。
2. イソフルランを用いてマウスを麻酔し、ノーズコーンに移動して麻酔を維持します。
3. 10％ポビドン/ヨウ素で両足をきれいに綿棒/ソリューション、2回繰り返して、エタノールが続く。毛皮の存在しているなら、クリーニングの前に脱毛脚（ナイールまたは同様の製品を使用）。
4. そっと外果、内果、と人差し指とthと脛骨の下半分を把握UMBは、その後（屈曲と外旋の組み合わせは、膝が表示されていてアクセスするような足を曲げる。
5. 明確な、厚い、白い線として見えなければならない膝蓋靭帯を、根底の視認性を高めるために70％エタノールを用いて皮膚を湿らせます。しっかりと28グラムのマウスインサート半針膝蓋骨下、膝蓋靱帯の真ん中を通しての足首/足を掴むと、脛骨の上部の前顆間区にしながら。
6. 脛骨に針を挿入すると、わずかに掘削アクションと安定した、しっかりと圧力を利用して成長板をよく導く。
7. 脛骨の成長板の浸透時に、針が著しく少ない抵抗に遭遇するでしょう。
8. 針は脛骨と成長板を介してであることを確認するために、針の穏やかな、横方向の動きを使用しています。針は脛骨内の適切な場所にある場合、動きが制限されます。
9. 徐々に細胞溶液の10μlを注入するためにプランジャーを押し下げます。抵抗なしに少しは、この時点で感じられるはずです。
10. SLOwly針を抽出します。
11. 同じ手順に従って、PBS10μlを注入するために次のレグに進みます。
12. 麻酔からマウスを外して、回復するまで加熱パッドを続ける。
13. 次の24時間にわたってマウスを監視して、動物が苦痛の徴候を示し続ける場合は、追加Buprenexですべて12時間を注入します。

5。撮像時間コース

1. ルシフェラーゼイメージング：該当し、ルシフェラーゼイメージングは​​7日後の腫瘍細胞接種（ほとんどの骨転移モデルにおけるもっとも、近い14日目に検出可能）で開始に利用されるべきである。マウスは、150 mg / kgのルシフェリン、麻酔を腹腔内に注射し、8分IVIS装置^8を使用^して注入した後に結像される。
2. GFPイメージングは：一般的にGFPを発現する腫瘍はマエストロイメージング機器^{（CRI）9を}使用^して心臓内実験用intratibial注射と16から21のために一日10から14の周りには検出され始める。簡単に説明すると、マウスはイソフルランで麻酔し（3％）とマエストロイメージングチャンバー内のノーズコーンを介して麻酔下で維持した。私たちのEGFP発現細胞のために私達は10 nmステップで500ミリ秒露出で青フィルターセット（EGFPの498 excitation/515エミッション）を使用します。
3. Faxitron（X線）：X線は毎週14〜7日の間に開始取られる。病変はintratibial注射³で21日目で心臓モデルに表示され、一週間早くなります。 のex vivoおよびin vivoでの我々のX線写真のデータは、暴露の8秒間35 200kVでFaxitron LX-60を使用して取得しました。
4. 他のイメージング：イメージングモダリティは完全に特定の研究に基づいて行われます。上記の方法に加えて、3Dマイクロコンピュータ断層撮影（μCT）、マイクロ陽電子放射断層撮影（μPET）、および他のモダリティ^10,11に基づいて生きている動物イメージングは、貴重な情報を提供することができます。

6。マウスサクリファイス

1. 各モデルには、わずかに異なる時間経過を持っています。 MDA-MB-2と31細胞のマウスには、通常、21と35日は通常、一日約28（それは21から28日の間にマウスを注入）との間の悪液質または下半身不随になる。
2. 一度に複数のマウスは、頸椎脱臼（または他の動物実験委員会の承認された方法）とケタミン/キシラジン過剰摂取を用いた研究ではすべてのマウスを犠牲にし、下半身不随になったり、体重の10〜20％の間で失う、皮質骨を突破し始める病変を発症。
3. バッファリングされた4％ホルマリンでさらなる研究とストアに必要な骨を取り除きます。
4. 胸の腫瘍を持つマウスは逃した注射のしるしであり、試験から除外されるべきである。

7。ex vivoで解析

1. μCT：70％EtOHにスキャンは、同じ骨片で測定するために、構造的および組織学的パラメータを可能にします。
2. 等高線や個々の実験計画や利用可能な装置¹⁰によると分析する。我々のデータは、12μmの解像度を使用してScancoμCT40で得られた。
3. Histomorphometry：望ましい組織学的方法を用いてプロセス標本とヘマトキシリン/エオシン⁷で染色

8。代表的な結果

腫瘍細胞の心臓内またはintratibial接種（ 図1）に続いてマウスはX線撮影および蛍光（または発光）で毎週監視されています。彼らはモデル（ 図2）に応じて、2週早ければ蛍光および発光により表示されることがありますしながら病変は、通常、週2と3の間にX線で明らかになる。病変は、骨の中の暗い穴として表示され、時間（ 図3）でより顕著になる。病変はX線写真のMetamorph分析を用いて定量化され、蛍光がマエストロ（CRI）画像取得と解析ソフトウェアを用いて定量した。病変が成長し始めると、マウスが頻繁に悪液質になる。マウスは彼らの最初の体重の10〜20％の間で失われたときに犠牲が必要となります。の条件マウスは、急速に変化することができ、日中に何度も監視する必要があります。 3-4週間の間にマウスは、1つまたは両方の後肢をドラッグし始め、全体の研究が犠牲になった。画像は、犠牲にする前に取られた。麻酔を大量に服用した後、血液は骨代謝やその他の要因のマーカーを測定するために収集した。頸椎脱臼した後、皮膚を切除し、マウスと骨から剥奪されたと、少なくとも7日以前のin vivoイメージング技術に比べて腫瘍病巣の可視化を可能にするのex vivoイメージング（ 図3）のために掃除した。イメージングが完了した後の骨は、ラベル付きカセットに入れて、固定し、さらに組織学的処理μCTまたは分析のためにホルマリンに保存されていました。組織形態計測はμCT後の腫瘍負荷およびBV / TVを示すために、サンプルで実施された骨破壊の量（ 図4）を定量化するために脛骨上で行った。

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図1。注射を適切に配置する。 ^第 4肋間で、心臓内接種のために左心室への針の適切な配置を示す成体マウスの胸部の腹radiographicalビュー（）。解剖学的ランドマークが胸骨上の水平の破線（白抜き）で示されている。マウスの皮膚に胸骨切痕とxyphoidプロセスは、ランドマークとして機能し、針が胸骨の左にわずかに挿入されます。顆の間に整列脛骨近位端に針の適切な配置を示す成体マウスの脚の腹側radiographical図（B）、。横方向の視点から針の先端が脛骨粗面と骨端軟骨板への深い後ろに配置されます。注入のための理想的な場所は、白丸で示されています。

図2。骨転移モデルの時間経過。caの進行X線やGFPを示すncer誘発性骨疾患+ in vivoでの腫瘍の蛍光画像intratibial注射（）と心臓内注射（B）から。

図3。 。、MDA-MB-231の心臓内注射後0日、14日、21日、および28でGFP蛍光を示すエクスビボ画像： 心臓、MDA-MB-231モデルの一番上の行の時間経過 。 14日目に腫瘍病巣が軟部組織を除去した後のex vivoでのみ表示されますので注意してください。下段：溶骨性骨病変を示す同じ大腿骨の ex vivoで放射線画像。骨の破壊が3週間心臓注射後まで通常表示されていないことに注意してください。

図4。骨転移の進行の定量化。GFP + tibiのマエストロのex vivoイメージングにより可視化などの腫瘍非担癌マウス（）および4週間、MDA-MB-231サブクローン（B）を発現しているGFPの心臓内注射後のマウスのAE。腫瘍病巣はFaxitron（D）で示すように骨破壊の領域と相関する腫瘍（C言語）を使用せずに骨を比較した。 microCT測定から骨構造とミネラルのデータは健康な骨（E）および担癌骨（F）は骨破壊の領域が無効領域として示されているの3D画像としてレンダリングされます。さらに骨や腫瘍詳細は、対応するH＆E染色組織切片（G＆H）に見られる。

Discussion

腫瘍誘発性骨疾患の研究は、2つの最も一般的に使用されるが、心臓とintratibial接種そのうちのいくつかの動物モデルに依存しています。多くの場合、心臓、骨への転移を研究するための最良の選択肢であるが、それは完全な転移過程を表すものではありませんので、乳腺脂肪パッドまたは他の同所注射は、理想的には、その端部に向かって使用する必要があります。腫瘍細胞は、ヒト細胞を用いたほとんどの研究で、プライマリサイトから容易に転移しない、そうだとすれば、彼らは主に肺に転移。 4T1細胞の一部の株は^5,6骨に転移しますが、病変が定量化することがより困難に、小さく、細胞がマウスではなく人間です。さらに、GFP発現は4T1クローンが頻繁に長期的転移の研究^12を複雑^にすることができます使用されている免疫適格モデルにおいて免疫応答を惹起することができます。腫瘍誘発性骨疾患の他のモデルでは、骨髄腫のように、尾静脈INJを利用ections ^13。それは圧倒的にマウスが骨転移を開発する前に肺疾患で死亡する原因となって、肺に腫瘍をシードするようにしかし、このアプローチは、固形腫瘍の転移の研究のために動作しません。 Intratibial注射は、それが転移モデルではなく、確立された転移性骨疾患の進行を表すものではないとして、一般的に、あまり好意的には他の方法よりも閲覧されており、注射部位に炎症を引き起こす可能性があります。それにもかかわらず、この手順では、末期癌誘発性骨疾患に直接的な影響から初期転移のステップと設立を分離するのに便利です。さらに、多くの前立腺腫瘍モデルの場合には、骨⁴で一貫し、腫瘍の成長を可能にする唯一の方法です。

監視骨疾患のための技術の選択は、重要かつ接種経路として研究に固有のものです。我々のグループでは、トン、調査に応じて多くの異なる技術を利用その中で最も一般的な彼は、X線、蛍光および組織学である。多くのグループがルシフェラーゼイメージングに移行しているが、我々はルシフェラーゼトランスフェクトした細胞を用いて、我々は蛍光イメージングとX線との共局在化が容易とのより良い解剖学的詳細を得ることが少なく、骨転移を得ることを見出した。また、モダリティ間の直接比較は骨の中の早期発見のためのルシフェラーゼイメージングへの重要な利点が得られなかった。しかし、これらの実験を行う各グループは彼らの研究のため、それぞれのアプローチの有用性を評価する必要があります。

また、他の多くのモデルで利用も、詳細なex vivoで解析技術は、骨に固有のものです。我々は一般的にμCTによる骨量の減少を分析します。正常な骨を分析した研究と同様に実施しながら、担癌骨の分析は、マーカーとしての成長板の頻繁な損失や混乱によって複雑になる。組織学的分析はまた幾分腫瘍で微妙なアール非担癌骨や軟組織のために開発されたプロトコルと比較して、骨をベアリング。このプロトコルでは、最も一般的に我々のグループによって利用されるものにフォーカスを維持するためにex vivoでの分析の説明を制限してきた。 生体内分析と同様に、各グループには、アプローチが彼らの研究のために最高の仕事を決定する必要があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 human breast cancer cells	Originally ATCC-Internally cloned and selected
DMEM	GIBCO	11885
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
FBS	Atlas Biological	F-0050a
Trypsin	GIBCO	15400
Faxitron	Faxitron
Maestro	CRi
μCT scanner	Scanco
Athymic Nude Mice	Harlan	Fox nu -/-
Insulin Syringes (300 μl, 28.5 g)	Becton Dickinson	309300
IVIS	Caliper
Irradiated Rodent Diet	Teklad	2920x