Summary
CRISPR / Cas-systemer medierer adaptive immunitet i Bacteria og Archaea. Mange Cas proteiner foreslået at fungere som endoribonucleases virker på crRNA forstadier af varierende længde. Her viser vi tre forskellige tilgange til at generere pre-crRNA substrater for den biokemiske analyse af Cas endonuclease aktivitet.
Abstract
Samspillet mellem vira og deres prokaryote værter formet udviklingen af bakteriel og archaeal liv. Prokaryoter udviklet flere strategier til at unddrage virus-angreb, der omfatter begrænsning modifikation, mislykkede infektion og CRISPR / Cas-systemer. Disse adaptive immunsystem findes i mange bakterier og de fleste Archaea består af c lustered r egularly i nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) sekvenser og et antal C RISPR som associerede (Cas) generne (fig. 1) 1-3. Forskellige sæt af Cas-proteiner og gentager definere mindst tre store divergerende typer CRISPR / Cas-systemer 4. De universelle proteiner Cas1 og CAS2 foreslås at være involveret i udbredelsen af viral DNA, somvil generere en ny afstandselement mellem to gentagelser ved 5'-terminalen af en udragende CRISPR cluster 5. Hele klyngen transkriberes ind i en precursor-crRNA indeholdende alle spacer og gentagelsessekvenser og forarbejdes derefter af et enzym af forskellige Cas6 familien i mindre crRNAs 6-8. Disse crRNAs består af spacer-sekvens flankeret af en 5'-terminal (8 nucleotider) og en 3'-terminal tag afledt fra gentagelsessekvens 9. En gentagen infektion af viruset kan nu blokeret som ny crRNA vil blive instrueret af en Cas proteinkompleks (Cascade) til det virale DNA og identificere den som sådan via base komplementaritet 10. Endelig, for CRISPR / Cas type 1-systemer, vil nuclease Cas3 ødelægge den detekterede angriber DNA 11,12.
Disse processer definerer CRISPR / Cas som en adaptiv immunsystem prokaryoter og åbnede en fascinerende forskningsfelt for studiet af de involverede Cas proteiner.Funktionen af mange Cas-proteiner er stadig undvigende og årsagerne til den tilsyneladende mangfoldighed af CRISPR / Cas-systemer mangler at blive belyst. Potentielle aktiviteter af de fleste Cas proteiner blev forudsagt via detaljerede beregningsmæssige analyser. En større fraktion af Cas proteiner er enten vist eller foreslået at fungere som endonucleaser 4.
Her præsenteres metoder til at generere crRNAs og precursor-cRNAs til studiet af Cas endoribonucleases. Forskellige endonuclease assays kræver enten korte gentagne sekvenser, der kan umiddelbart syntetiseres som RNA-oligonukleotider eller længere crRNA og præ-crRNA sekvenser, der genereres via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. Denne metode tillader inkorporering af radioaktive nukleotider til generering af internt mærkede endonuclease substrater og oprettelse af syntetiske eller mutant crRNAs. Cas6 endonuklease-aktivitet anvendes til modning før crRNAs i crRNAs med 5'-hydroxyl og en 2 ', 3'-cyklisk phosphat termini.
Protocol
1. Generering af lange præ-crRNA substrater via PCR
- Design PCR primere rettet mod de spacer regioner af en CRISPR klynge. Tilsæt T7 RNA-polymerase (T7RNAP) promotorsekvens (5'-taatacgactcactata-3 ') til fremadrettet primer og restriktionssteder til kloning af PCR-produktet ind i en vektor til begge primere (f.eks BamHI og Hind III til pUC19, fig. 2A) .
Bemærk: T7RNAP kræver en guanidin rest for en korrekt initiering af transkription. - Forstærk din pre-crRNA sekvens af interesse fra genomisk DNA ved PCR.
- Adskille PCR-produkterne ved agarosegelelektroforese og gel ekstrahere det ønskede bånd. Fordøje den PCR-produktet med restriktionsenzymerne at skabe klæbrige ender (f.eks BamHI og HindIII, fig. 2A). Rense dit PCR-produkt med en PCR oprensningskit at eliminere spaltning biprodukter.
- Oprette en ligeringsreaktion, som indeholder T4-DNA-ligase, T4 DNA-ligase-puffer oget 3:1 molært forhold af det spaltede PCR-produkt og den dephosphorylerede lineære pUC vektor med tilsvarende klæbrige ender. Inkuber blandingen ved 16 ° C natten over. Omdanne ligeringsblandingen ind i kompetente Escherichia coli DH5a-celler ved standardprotokoller, og anvende hvid screening for at identificere succesfuld ligering.
- Isoler plasmider fra hvide kolonier under anvendelse af en plasmid forberedelse kit. Identificere positive kloner ved plasmidsekventering. Alternativt kan koloni-PCR anvendes til screening.
2. Generering af mellemprodukt pre-crRNA substrater via annealing af DNA-oligonukleotider
- Design frem og bak oligonukleotider med den ønskede CRISPR repeat / spacer sekvens. Oligonukleotiderne indeholder sekvensen af en T7-RNAP-promotor samt terminale restriktionssteder (fx BamHI og Hind III for pUC19). Ophæve oligonukleotiderne at sikre, at klæbrige ender form efter annealing (se fig. 2B
- 5'-phosphorylerer 1 nmol af hvert oligonukleotid i en separat 20 ul reaktion indeholdende 5 ul af T4-polynukleotidkinase (PNK), 2 ul T4 PNK 10x buffer, 2 pi ATP (10 mM). Inkubér hver prøve i 1 time ved 37 ° C.
- Hybridiserer de to phosphorylerede oligonucleotider. Kombiner 1 pi af den phosphorylerede frem oligo-blanding (fra 2,2.), 1 ml af den phosphorylerede reverse oligo-blanding (fra 2,2.), 1 ul T4 DNA ligase 10x buffer i en 10 pi reaktion. Inkuber prøverne i 5 minutter ved 95 ° C på en varmeblok eller i kogende vand, slukke for varmekilden og lad blandingen afkøle til stuetemperatur (~ 2-3 timer).
Bemærk: I denne kritiske trin, fremmer den langsomme afkøling af annealing af de to oligonukleotider i forhold til dannelsen af strukturer i hvert enkelt oligonukleotid. - Ligere 4 pi af hybridiseringsblanding, 1 pi af fordøjet og dephosphoryleret pUC-vektor (0,1 ug /pi) med T4 DNA-ligase, T4 DNA-ligase 10x buffer og 10 mM ATP i et 20 ul ligeringsblanding. Prøven inkuberes ved 16 ° C natten over.
- Omdanne de ligerede plasmider til kompetente Escherichia coli DH5a-celler ved standardprotokoller, og udnytte hvid screening. Isoler plasmider og identificere positive kloner ved fordøjelse (at screene for indsatse med den ønskede størrelse) og efterfølgende plasmidsekventering.
3. Generering af korte Cas RNA-substrater via tilpassede RNA oligonukleotidsyntese
Design short Cas RNA-substrater (f.eks single gentagelsessekvenser, fig. 2C) og anvende brugerdefinerede RNA oligonucleotidsyntesemetoder faciliteter.
Bemærk: optagelse af et deoxyribonukleotid ved en bestemt position af et RNA-oligonukleotid (fig. 2C) kan anvendes til at lokalisere stedet for RNA-spaltning.
4. In vitro T7 RNA-polymerase-transkription
- Isoler plasmider med din designet konstruktion (fra 1,9. Eller 2,7.) Med en maxiprep plasmidoprensning kit.
- Linearisering af plasmidet med restriktionsenzymet, som spalter nedstrøms for det klonede fragment (f.eks HindIII). Sikre fuldstændig fordøjelse.
Bemærk: Hvis en divergerende defineret 3'-ende af RNA-transkriptet er ønsket, bør konstrueret konstruktion indeholde et yderligere specifikt restriktionssted til "afløb" transkription opstrøms for HindIII-sekvensen. - Renses det lineariserede plasmid ved phenol: chloroform (1:1) ekstraktion og ethanoludfældning. Recover nukleinsyrerne ved at resuspendere pelleten i DEPC behandlet sterilt vand.
- Etablere en in vitro T7 RNAP køre off transcription blanding, som indeholder 40 mM Hepes / KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol, 1 mM spermidin, 4 mM af hver nucleosidtriphosphat (ATP, CTP, GTP, UTP ), 40-100 pg / ml spaltetplasmid og 0,1 mg / ml T7 RNAP i DEPC behandlet vand. Der inkuberes i 3 timer ved 37 ° C.
- Analysere de opnåede RNA-transkripter på en denaturerende 8 M urinstof 12% polyacrylamidgel (fig. 3A). RNA-transkripterne kan oprenses via Mono Q anionbytningschromatografi 13 og genvindes ved ethanolfældning af RNA-fraktioner og resuspension af pelleten i DEPC behandlet sterilt vand. Til fremtidig brug, opbevares RNA ved -80 ° C.
5. Cas6 endonuclease assay
- Konfigurer en 20 pi in vitro T7 RNAP køre off transcription blanding (se 4.4), som indeholder en reduceret mængde af 2 mM ATP og suppleres med 2,5 pi α-[32P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Oprense reaktionsprodukter gennem gel ekstraktion fra en denaturerende 8 M urinstof 12% polyacrylamidgel. Visualisere bånd ved autoradiografi.
- Fremstilling og oprensning af den ønskede rekombinant Cas proteiner. I dette eksempel CAS6 fra Clostridium thermocellum blev oprenset via varme-udfældning og Ni-NTA-kromatografi.
- Oprette en endonuklease assay reaktion (f.eks Clostridium thermocellum Cas6, reaktionsblandingen indeholder 20 mM Hepes (KOH pH 8), 250 mM KCI, 2 mM MgCI2, 1 mM DTT, 12.000 cpm RNA substrat og 1 uM enzym og blev inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter).
- Indlæse 5 pi af reaktionsblandingen (+ 10 pi RNA loading buffer indeholdende 95% formamid) på en 8 M urinstof 12% polyacrylamidgel. Visualisere spaltningsprodukterne efter elektroforese ved autoradiografi.
6. Repræsentative resultater
Et eksempel på RNA-substrater til analyse af Cas endonuklease-aktivitet er vist i figur 3A. En alikvot af 5 pi af en analytisk 100 pi in vitro transcription reaktionen blev fyldt. Bemærk, at effektiviteten af RNA-produktion varierer mellem forskellige konstruktioner. Nogle faktorer that blev observeret at påvirke mængden af opnået RNA er (i) den oprindelige sekvens efter en G kræves til transkriptionsinitiering, (ii) muligheden for RNA-struktur dannelse under transkription og (iii) valg af restriktionssted til frembringelse af den run-off spaltning position.
Undersøgelsen af RNA-endonuklease-aktivitet kræver både højt oprenset rekombinant Cas-proteiner (fig. 3B) og passende negative kontroller. Ideelt set denne negative kontrolprøve afviger så lidt som muligt fra de undersøgte Cas endonuclease reaktion. Dette kan opnås ved inkubering af RNA med reaktionsbuffer og celle-lysat uden Cas ekspression (og efter den samme rensningsprocedure). En ideel negative kontrol er tilsætning af et deoxyribonukleotid på det foreslåede spaltningssted. I figur 3C er spaltningen af en 5'-terminal mærket repeat sekvensen vist i Clostridium thermocellum Cas6. Under identiske betingelser, denne gentagelse er ikke et substrat længere, når en deoxyribonukleotid indføres i position -9. Denne fremgangsmåde tilvejebringer også information om spaltningsstedet. Endelig er en lang internt mærket pre-crRNA spaltet af Cas6 og to spaltningsfragmenter overholdes.
Figur 1. Skematisk oversigt over CRISPR / Cas-aktivitet. Oversigten følger indsættelse af en viral DNA-sekvens (protospacer) i CRISPR klynge (tilpasning), transkriptionen og behandling af CRISPR-array i små crRNAs af en Cas6 endonuklease, indførelse af crRNAs i Cascade kompleks og interferensen af en gentagen viral angreb baseret på komplementaritet mellem crRNA og protospacer. Protospacer tilstødende motiver (PAM) mark virale protospacer sekvenser.
igur 2 "src =" / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg "/>
Figur 2. Dannelse af RNA-substrater for Cas proteiner. Ordningen viser arbejdsgangen til frembringelse af (A) lang præ-crRNA substrater, (B) mellemprodukt før crRNA substrater og (C) short Cas RNA-substrater for pre-crRNA produktion. Eksempel sekvenser præsenteres for den CRISPR vifte af Clostridium thermocellum. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Cas6 endonuclease assay. A.) toluidinblåt farvede polyacrylamidgel af et specialfremstillet RNA-oligonukleotid (250 pmol) og to in vitro RNA-transkripter (5 pi af en typisk 100 pi reaktion). B.) SDS-PAGE gel af et Cas6 præparat (80 pmol) fra Clostridium thermocellum efter varmebehandlingenudfældning ved 50 ° C i 1 time og Ni-NTA-kromatografi. C) påvisning af endonucleolytisk Cas6 aktivitet for 5'-terminale mærkede gentagelsessekvenser og præ-crRNA in vitro-transkripter. Indførelsen af en dNTP ved position -9 afskaffer Cas6 spaltning i en kort Cas RNA-substrat (S, fig. 2C). En 5 'terminal 8 nt tag genereres også for crRNA modning af lange præ-crRNA substrater (L, fig. 2A). Båndene blev adskilt på en denaturerende 8 M urinstof 12% polyacrylamidgel og visualiseret ved autoradiografi.
Discussion
De præsenterede metoder gør det muligt generation af CAS endonuclease substrater af forskellige størrelsesområder og med varierende frihed i rækkefølge design. Den mest ligetil fremgangsmåde til generering af syntetiske RNA-oligonukleotid substrater er begrænset til korte RNA-motiver på grund af stigende omkostninger og tekniske begrænsninger i at skabe længere RNA-oligomerer. Mens vellykket RNA-syntese er blevet rapporteret for umodificerede RNA-oligomerer af mere end 100 nukleotider længde, praktisk og økonomisk maksimum for brugerdefinerede RNA-syntese ligger under 40 nucleotider. Imidlertid kan enhver given sekvens, syntetiseres og målrettet indførelse af modificerede nukleotider (f.eks deoxyribonukleotider) kan anvendes til at analysere spaltningssteder i detaljer. Længere pre-cRNAs skal genereres via in vitro transkription.
Annealing af oligonukleotider, der indeholder en T7 RNA-polymerase-promotor muliggør fremstilling af intermediær længde pre-crRNSom. Den maksimale længde af rutinemæssigt og økonomisk syntetiserede DNA-oligonukleotider er lige over 150 nukleotider, og repræsenterer den maksimale syntetiske pre-crRNAs via denne metode. Samlingen af flere annealede DNA oligonukleotidpar, som danner klæbrige ender med hinanden kan udvide denne maksimal længde, men kræver stigende udfordringer i kloning af konstruktionen. Den væsentligste fordel ved denne metode er evnen til at frembringe forud crRNA konstruktioner (og derfor Cas endonuklease substrater) med hvilken som helst ønsket sekvens. Dette tillader afprøvning af syntetiske crRNA designs.
Endelig kan større pre-crRNAs opnås fra PCR amplifikaterne af hele genomiske CRISPR elementer eller fraktioner deraf. Ændringer af in vitro transcription template plasmid kan indføres via site-directed mutagenese til frembringelse af præ-crRNA varianter. Disse konstruktioner kan anvendes til at analysere den globale endonukleolytisk spaltning mønster i en helpre-crRNA.
The pionerarbejde til fremstilling af umodificeret RNA via T7-RNA-polymerase in vitro transcription var baseret på transfer RNA'er 14 og brome mosaikvirus RNA 15. Den konsensus T7 RNA-polymerasepromotor består af en anerkendelse domæne (-17 til -5) og en indledning domæne (-4 gennem 6) med transkriptionsinitiering ved et væsentligt guanosin en 16. Positioner nedstrøms for en kan varieres som muliggør transkription af næsten alle ønskede RNA-sekvens. De præsenterede fremgangsmåder til generering in vitro run-off transcription skabeloner muliggør in vitro-syntese af komplette præ-crRNAs der svarer genomiske CRISPR regioner eller syntetiske pre-crRNA varianter. Transkripterne genereres med en 5'-terminal triphosphat stede medmindre transkriptionsreaktion primes med GMP til opnåelse af 5'-monophosphat termini 14. Sådanne terminaler er påkrævet, hvis transkripterne skal mærkesmed T4-polynukleotidkinase og γ-[32P]-ATP. Spaltningsaktivitet af Cas6 og Cas6-lignende enzymer genererer crRNA, der indeholder 5'-hydroxyl-og en 2 ', 3'-cyklisk phosphat termini. Disse RNA'er kan derefter analyseres for genkendelse af Cascade komplekset.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Jeanette Schermuly til fremstilling af rekombinant T7 RNA-polymerase og Norman Ebelt for bistand til forberedelsen Figur 1. Dette arbejde blev finansieret af midler fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) og Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
| in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 - NU-1013 | |
| Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
| DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
| RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
| Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| BamHI | NEB | R0136L | |
| HindIII | NEB | R0104L | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
| T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
| Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
| Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
| Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
| Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
| Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
| Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
| pUC19 | NEB | N3041S | |
| γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |
References
- Barrangou, R. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315, 1709-1712 (2007).
- Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol. Direct. 1, 7 (2006).
- Lillestøl, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. A putative viral defence mechanism in archaeal cells. Archaea. 2, 59-72 (2006).
- Makarova, K. S. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).
- Brouns, S. J. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
- Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6. RNA. 16, 2181-2188 (2010).
- Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease. Science. 329, 1355-1358 (2010).
- Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).
- Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes. Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).
- Wiedenheft, B. Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system. Nature. 477, 486-489 (2011).
- Garneau, J. E. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468, 67-71 (2010).
- Sinkunas, T. Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system. EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).
- Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., Söll, D. Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction. Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).
- Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).
- Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities. Nature. 311, 171-175 (1984).
- McGinness, K. E., Joyce, G. F. Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element. J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).
