膜片钳记录在内耳毛细胞的分离斑马鱼

Summary

这个视频的目的是为了证明程序获得的成年斑马鱼的内耳器官的健康，完整的毛细胞，然后利用他们为特征的生物物理特性的电压门控离子通道的膜片钳研究的目的。

Abstract

从不同的物种中分离的感觉毛细胞的电压门控通道的膜片钳分析前面描述的^1-4，但这个视频的第一个应用程序，这些技术从斑马鱼的毛细胞。在这里，我们表现出的内耳器官，lagena：球囊，椭圆囊和半规管的方法分离健康，完整的毛细胞。此外，我们证明了毛细胞的大小和形态的多样性，举一个例子，可以得到的膜片钳记录种。这种斑马鱼模型系统的使用比其他的优点源于斑马鱼突变体的可用性，同时影响听觉和平衡。结合使用转基因株系和其他技术，利用遗传分析和处理，细胞分离和电生理的方法，这里介绍的角色毛细胞p应促进更深入地了解躺在调解这些感觉。

Protocol

1。实验前的准备工作

1. 准备6的解决方案（见表1的组合物）：（一）100毫升NZR（一般斑马鱼林格氏的），（二）50毫升NZR +三卡因（MS222），（三）10毫升NZR + BSA;（四）100毫升的LOCA （低Ca ^{2 +的}溶液）和（e）10毫升LoCaS +木瓜蛋白酶，（六）100毫升^ķ+内部 ​​溶液。解决方案（一），（二），（d）和（f）可以被存储在4℃下长达一个月（三）及（e）应准备好一天的实验。在开始实验前，所有的解决方案应该是在室温下。
2. 标签和填补四张35毫米的培养皿中约一半的解决方案（a）中，（c）中，（d）和（五）。
3. 解剖盘填补了60毫米的培养皿中，用Sylgard（道康宁密歇根州米德兰市），然后把它切割腔，让鱼坐直没有翻倒。
4. 准备至少两个细胞的分离工具，通过胶合卵泡端的狗毛玻璃结束巴斯德吸管与强力胶，使头发过去的移液管的端部延伸，由约0.5厘米。软毛的狗，拉布拉多猎犬威玛猎犬一样的毛发正常工作。

2。分离，听觉和前庭迷路

1. 牺牲我一个成年斑马鱼浸泡在一个烧杯中NZR +三卡因​​。可视化监控的鳃，鳃盖运动停止，直到所有的。再等待10分钟，然后取出鱼和新鲜NZR冲洗。这些程序已被批准的实验动物护理和使用委员会（IACUC），佩珀代因大学（Pepperdine University），但应该从自己的机构批准。
2. 引脚的鱼解剖菜背侧通过插入一个标准缝纫直针（约2.5厘米长）通过每个眼窝和三分之一引脚通过背腹轴约三分之一到二分之一的距离，从头部所示的尾图1A中。
3. 在一个变焦（0.62-5X）配有10倍的目镜的立体解剖显微镜下，用春风似剪刀（精细的科学工具目录号15000-02），暴露大脑和脊髓一小段取出的头骨屋顶从约0.5厘米尾鳍着鼻子的鱼鳃的水平。切脊髓，用细镊子（精细的科学工具目录号11251-30）的同时，减少脊髓神经和其他附件，解除大脑，消除大脑和丢弃（ 图1B）。
4. 腹一半的头骨胶囊，仍然形成一个“碗”，其中包含的内耳器官。遵守突出的，白色的，不透明的耳石在lagenas和sacculi对称地位于尾端的每个内耳和横向放置的椭圆囊耳石吻侧（ 图1C和4A）。
5. 取出一碗骨头切割腹部和侧依恋TS，同时轻轻抬起它的头用细镊子。将它放置到培养皿中的LOCA（ 图1D和4B）。
6. 使用2双细钳子，裂纹在中线通过敛骨的横向边缘和拉动它们分开，或者，分离插入钳子的各点在中心和撬半部左，右两半分开，碗分开。从骨头中取出两个迷宫用细镊子（ 图2）。
7. 检查的迷宫，，识别听觉和前庭终器官：半规管，椭圆囊，sacculi和lagenas（ 图4C）。根据每个耳石的粉红色的斑疹，含毛细胞。同样地，带粉红色的里面的半圆形运河壶腹标识位于毛细胞的吸盘。
8. 小心地取出用细镊子从lagena和囊耳石（

3。毛细胞分离

1. 使用的塑料移液管（Fisher科学产品目录号13-711-上午09点），移动结束器官的培养皿中LoCaS +木瓜蛋白酶转移的流体的体积最小化。
2. 孵育30分钟，在室温下在此溶液中的这些结构。
3. 在年底的潜伏期，NZR + BSA培养皿中移动的结构，并在此溶液中孵育至少30分钟。在此解决方案中，毛细胞保持健康，长达四个小时，而且会损坏隔离后1-2小​​时后（请参阅下面的步骤）。
4. 在筹备细胞的分离，移动的最终器官的培养皿中NZR。
5. 对于的lagenas和椭圆囊，狗的头发轻轻抬离斑疹张粉红色的上皮TIssue包含毛细胞（图3A）。斑疹可以舀出（用狗毛）从在耳石的sacculi，从他们的位置的半规管壶腹内的cupulae。
6. 使用两个准备步骤1.4中的细胞分离工具，捣碎，而斑疹或吸盘产生的碎片字段中包含的毛细胞（图3B）。允许细胞定居的菜的底部上移动它之前的至少五分钟。
7. 移居他的菜，配有相衬光学倒置显微镜的阶段。 40倍的放大倍率下观察细胞，并注意形态的多样性。许多细胞，而另一些牛油果形长而薄的。顶束发的存在将其标明为毛细胞相亮度的保证他们的健康。孤立的毛细胞的显微照片示于图5。

4。膜片钳斑马鱼的毛细胞

1. 在准备射孔录音^5,6额定补丁，准备两性霉素含内部解决方案如下：将5毫克两性霉素B（适马A4888）至1.5 ml离心管中，并填写用100μlDMSO。立即涡此溶液中10秒至20秒，直到所有的两性霉素溶解。然后，移液管625微升K ⁺内部 ​​解决方案，成为第二个离心管中。加入10μl的两性霉素溶液的K ^+-内部溶液和涡如上。股票两性霉素溶液会持续数个小时，但一小时后丢弃的最终解决方案。
2. 制作补丁移液器从BF 150-86-10硼硅酸盐玻璃（萨特仪器），使用多级的牵拉（萨特P-1000）。吸量管应该尖端约2微米的直径，并且将有1-3的电阻MΩ与表1中的解决方案。拉拔器上的设置工作如下：热量=斜坡minus10，拉= 0时，速度= 18，延迟= 1，压力= 600。的形状的良好的吸液管的尖端是显而易见的，从图5中的插图c的照片。钝的“子弹头形”的吸液管是首选，因为他们提供的电生理记录至少访问时的阻力。
3. 使用的28号的Microfil注射器针（MF28G-5，世界精密仪器），以填补记录电极与两性霉素含K ⁺内部 ​​解决方案的一半。
4. 贴上电极膜片钳放大器的探头。应用-10毫伏，10毫秒的电压的步骤在10赫兹，并保持正的压力，因为它是通过气/液界面操纵和向下的记录盘的底部附近的细胞在电极中。
5. 垂直的电极放置一个健康的细胞。当电极是足够近的小区，这样它开始移动远离满分流动的溶液，快速反向压力，轻微的真空施加到所述电极，直到细胞在其上的“跳跃”。立即停止对日的吸E电极，并应用到所述电极的内侧的保持电位为-70 mV。在几秒钟内将形成一个gigaohm密封。
6. 观察后不久出现密封形成的电压的步骤的起始和终止的容性电流瞬变。继续监视的膜穿孔电极两性霉素看的瞬态增长幅度最大尺寸（约十分钟）。
7. 要确认建立在一个健康的细胞的全细胞（穿孔）的配置，通过施加超极化和去极化电压的步骤引起外向K ⁺电流。大多数毛细胞具有显着的的向外电流（ 见图6）。

5。代表性的成果

图4示出了在细胞分离步骤期间拍摄的图像。在面板的lagenas，saccluli和椭圆囊耳石可以看到THROUGH一层薄薄的骨之上。这些不透明的结构提供了方便地标有助于剥离在随后的步骤中的安全移除的端部从该动物器官。图B显示的“碗”的骨骼包含完整的椭圆囊，lagenas和sacculi的在迷宫和突出的耳石。面板C示出了已经从骨骼上移除的迷宫。注意大的扇形在lagena边缘耳石，的冰柱形耳石，在球囊和椭圆囊豆状耳石。某些可见在从lagena分离的细胞的大小和形态的多样性是图5中所示。一个健康的细胞很容易识别相亮用锋利的周边。细胞形态大致可以分为两大类：鳄梨形（避免）和长和薄（THN）虽然在每一组内的单元格的大小可以显着不同（例如，避免1和避免3比较）。插图示出的群集3细胞，并没有完全被彼此隔离。 插图 B中的单元格的黑色和颗粒状的外观容易标识此细胞为死亡。插图c显示了示出用于记录从这些细胞的形状和尺寸适当的一个补丁吸管尖端。

响应于超极化和去极化上lagena细胞类似于图5中所示的避免2所施加的电位的步骤中得到的在图6中所示的电流的痕迹。电流反应在不同大小和形状的细胞，可以很宽的范围内变化暗示在补体的电压门控通道的多样性。

图1-3：卡通毛细胞的隔离步骤说明。

图1去除头骨capsu的。乐从斑马鱼内耳的迷宫。针牺牲斑马鱼背解剖盘。B。开放性颅骨，删除和丢弃的大脑。C。观察耳石在椭圆囊，lagenas和sacculi。D。删除腹侧部分头骨胶囊含有的迷宫。

图2。去除头骨胶囊的迷宫。A。除了 ​​头骨胶囊在中线破解。B。删除迷宫骨C。取出使用产钳的lagenas和椭圆囊耳石。

图3。迷宫毛细胞的分离。轻轻抬离马与狗的头发culae。B。捣碎斑疹与两个狗的毛发。 C.使用隔离膜片钳毛细胞。

图4。拍摄的图像的单个细胞中的隔离在步骤A.除去后的大脑，两个lagenas和sacculi（箭头）和小囊（箭头）与耳石可以可视化。B.除去的腹侧后部：颅骨胶囊，它包含从动物的内耳机关。卡通中的右半B 的标识左边的的囊，lagena和球囊的位置。虚线表示的近似位置的左侧的迷宫。C。右迷宫（中间图）D：卡通说明在 C中的关键部分迷宫。答：前半B：圆形管，水平管，C：后路椎管，D：E：椭圆囊耳石，囊状耳石，F：瓶状囊耳石。在D中的比例尺为A和B表示1毫米，0.5毫米，C和D。

图5。lagena说明形态的多样性; AVO：牛油果形细胞; THN：长，薄的细胞隔离，健康的细胞。插入一个三不完全分离出细胞群; 插图 B：死细胞;插图ç：在斑马鱼的毛细胞的电生理记录使用的贴片电极尖端。比例尺= 20微米的主图和所有插图。

图6。修补程序中的电流钳位毛细胞。平均反应的细胞（类似TØ避免在图5），适用于从-140 mV的10 mV为增量从保持电位为-70 mV至+70 mV的电压步骤介绍。请注意，出现在更多的去极化电位的失活电流。阶跃电压幅值下的痕迹。

Discussion

小心剥离结束的器官和温和处理的细胞是健康的，完整的和生理活性的毛细胞的成功的隔离至关重要。遵循以下提示，确保成功：

1. 这是比较容易得到健康的细胞从较小的鱼（2-2.5厘米长）。更大的鱼有更多的脂肪滴在剥离过程中，晦涩的可视化。
2. 必须小心除去的的耳石，其中叠置毛细胞时。避免接触细胞时，用钳子抓住了耳石。
3. 时，得到最好的结果的斑疹和cupulae的被剥离纸片和细胞从上皮研制。
4. 我们找到狗的头发，捣碎细胞优于其他方法，包括使用人的睫毛是锥形和灵活的使用。
5. 在膜片钳，应用正压吨他电极，因为它通过的气/液界面是重要的是保持清洁的前端。的正压力的释放，使细胞在电极上的“跳”也是很重要的。此方法清除小体积的含两性霉素-溶液远离尖端，从而增加与细胞形成gigaohm密封的可能性。在我们的实验中，我们使用的更传统的全细胞记录技术，而不是因为脆弱的细胞穿孔修补程序。 “全细胞”，往往造成损失的gigaohm密封。

这里描述的方法，将产生数百个健康的头发细胞，每只动物。该技术可以在室温下进行，并超出在解剖显微镜不需要专门的设备。朱庇特先前的一份报告中说明使用的腹侧的方法⁸斑马鱼内耳的解剖。这些表明，狄氏ction完整的，多聚甲醛固定的内耳器官。我们鼓励读者观看此视频相比，我们的方法。这里提出的方法的优点之一是获得有用的活细胞的生理调查。除了 ​​它们的使用在膜片钳实验中研究的电压门控离子通道（如这里所示）可以扩展到使用这些细胞研究细胞共振^9,10神经递质的释放，显示器通过使电容测量^11,12，调查神经调节诱导以及挖掘到丰富的信息，我们可以从使用影响听力和平衡^14的突变体，配体门控离子通道的激活^13。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(a) NZR (Normal Zebrafish Ringer's) (in mM)	116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 Glucose, 5 Na+-HEPES, pH 7.35.
(b) NZR + Tricaine	NZR + 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester methane sulfonate (Sigma A5040).
(c) NZR + BSA	NZR + 0.4% Bovine Serum Albumin (Sigma A2153).
(d) LoCaS (Low Ca2+ Solution) (in mM)	100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl2, 0.05 MgCl2, 3 Glucose, 30 Na+-HEPES, pH 7.35.
(e) LoCaS + papain	LoCaS + 0.05% L-cysteine (Sigma C1276) + 0.2% papain (Sigma P3375).
(f) K+-internal solution (in mM)	52 K2SO4, 38 KCl, 1 K+-EGTA, 5 K+-HEPES, pH 7.3.
Table 1. Solutions.