这个视频的目的是为了证明程序获得的成年斑马鱼的内耳器官的健康,完整的毛细胞,然后利用他们为特征的生物物理特性的电压门控离子通道的膜片钳研究的目的。
从不同的物种中分离的感觉毛细胞的电压门控通道的膜片钳分析前面描述的1-4,但这个视频的第一个应用程序,这些技术从斑马鱼的毛细胞。在这里,我们表现出的内耳器官,lagena:球囊,椭圆囊和半规管的方法分离健康,完整的毛细胞。此外,我们证明了毛细胞的大小和形态的多样性,举一个例子,可以得到的膜片钳记录种。这种斑马鱼模型系统的使用比其他的优点源于斑马鱼突变体的可用性,同时影响听觉和平衡。结合使用转基因株系和其他技术,利用遗传分析和处理,细胞分离和电生理的方法,这里介绍的角色毛细胞p应促进更深入地了解躺在调解这些感觉。
小心剥离结束的器官和温和处理的细胞是健康的,完整的和生理活性的毛细胞的成功的隔离至关重要。遵循以下提示,确保成功:
这里描述的方法,将产生数百个健康的头发细胞,每只动物。该技术可以在室温下进行,并超出在解剖显微镜不需要专门的设备。朱庇特先前的一份报告中说明使用的腹侧的方法8斑马鱼内耳的解剖。这些表明,狄氏ction完整的,多聚甲醛固定的内耳器官。我们鼓励读者观看此视频相比,我们的方法。这里提出的方法的优点之一是获得有用的活细胞的生理调查。除了 它们的使用在膜片钳实验中研究的电压门控离子通道(如这里所示)可以扩展到使用这些细胞研究细胞共振9,10神经递质的释放,显示器通过使电容测量11,12,调查神经调节诱导以及挖掘到丰富的信息,我们可以从使用影响听力和平衡14的突变体,配体门控离子通道的激活13。
The authors have nothing to disclose.
由美国国家科学基金会(0854551)资助。
Solution Name | Recipe |
(a) NZR (Normal Zebrafish Ringer’s) (in mM) | 116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 Glucose, 5 Na+-HEPES, pH 7.35. |
(b) NZR + Tricaine | NZR + 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester methane sulfonate (Sigma A5040). |
(c) NZR + BSA | NZR + 0.4% Bovine Serum Albumin (Sigma A2153). |
(d) LoCaS (Low Ca2+ Solution) (in mM) | 100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl2, 0.05 MgCl2, 3 Glucose, 30 Na+-HEPES, pH 7.35. |
(e) LoCaS + papain | LoCaS + 0.05% L-cysteine (Sigma C1276) + 0.2% papain (Sigma P3375). |
(f) K+-internal solution (in mM) | 52 K2SO4, 38 KCl, 1 K+-EGTA, 5 K+-HEPES, pH 7.3. |
Table 1. Solutions.