Deze video presentatie toont een werkwijze voor het oogsten van de twee belangrijkste zeer vasculaire structuren die voorhersenen functie ondersteunen. Zij zijn de cerebrale oppervlak (oppervlakkige) vaatstelsel, samen met de bijbehorende hersenvliezen (MAV) en het vaatvlies plexus die nodig zijn voor cerebrale doorbloeding en de cerebrospinale vloeistof (CSF) homeostase.
Deze video presentatie is gemaakt om een methode van het oogsten van de twee belangrijkste hoogst vasculaire structuren laten zien, niet woonachtig zijn in de hersenen zelf, die ondersteuning voorhersenen functie. Zij zijn de cerebrale oppervlak (oppervlakkige) vaatstelsel, samen met de bijbehorende hersenvliezen (MAV) en het vaatvlies plexus die nodig zijn voor cerebrale doorbloeding en de cerebrospinale vloeistof (CSF) homeostase. Geoogste weefsel is geschikt voor biochemische en fysiologische analyse en de MAV is en gevoelig voor schade door amfetamine en hyperthermie 1,2. Als goed, de grote en kleine cerebrale vasculatures geoogst in MAV zijn van potentieel hoog belang bij het onderzoek concussive soorten hoofdletsel. De MAV ontleed in deze presentatie uit de pial en enkele arachnoidea membraan (minder dura) van de meninges en de grote en kleine bloedvaten cerebrale oppervlak. De choroid plexus ontleed is de structuur dat zich in het lateral ventrikels zoals beschreven door Oldfield en McKinley 3,4,5,6. De methoden voor het verzamelen van deze twee weefsels vergemakkelijken ook het verzamelen van regionale corticale weefsel zonder meninges en grotere cerebrale vasculatuur oppervlak, en is compatibel met andere oogsten hersenweefsel zoals striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. De ontleding van de twee weefsels wordt 5 tot 10 min totaal. De genexpressie niveaus voor de MAV ontleed en choroidea plexus, zoals getoond en beschreven in deze presentatie is te vinden op GSE23093 (MAV) en GSE29733 (choroidea plexus) op de NCBI GEO repository. Deze gegevens zijn, en wordt, gebruikt om beter inzicht in de werking van de MAV en choroidea plexus en hoe neurotoxische gebeurtenissen zoals ernstige hyperthermie en Amph negatieve invloed hebben op hun functie.
Technische aspecten van MAV en choroidea plexus dissectie
Het is cruciaal tijdens de dissectie van de MAV om de hersenen "ondergedompeld" meestal in de normale zoutoplossing of natriumfosfaat-gebufferde zoutoplossing. Waardoor de MAV en cortex te ontwateren tijdens dissectie zal resulteren in de MAV hechten stevig aan corticale laag I. Dit zal de hoeveelheid corticale weefsel geoogst met de MAV en / of resulteren in het onvermogen om deze aanhangend MAV secties uit de cortex verhogen. Ook geduld is nodig tijdens dissectie. Nogmaals, als men kennis met weerstand in het verwijderen van de MAV van de cortex in een halfrond tijdens dissectie, overschakelen naar het andere halfrond en later terug te gaan naar de kant waar weerstand werd ondervonden. Deze methode vergt wel enige oefening om een perfecte en vereist ongeveer 5 tot 15 "praktijk" dissecties voor een consistent uniform oogst van MAV weefsel wordt bereikt. De werkwijze begint de dissectie en removal van de MAV de arteriële cirkel aan de basis van de hersenen vergemakkelijkt het verwijderen van de hersenvliezen door de grotere vasculatuur support "scaffolding."
Veel van de oorspronkelijk in het bloed MAV vasculatuur Na opoffering worden uitgeworpen tijdens de dissectie en minder dan 5% van het RNA geoogst MAV moet bloed oorsprong. Het is mogelijk om bijna alle bloed te verwijderen te doorstromen het dier met 50 tot 70 ml zoutoplossing met histologische technieken, vóór onthoofding en de hersenen verwijderd. Het is echter veel moeilijker dan de MAV weefsels tijdens dissectie visualiseren. De drie meest waarschijnlijke "vervuiling" van het weefsel MAV de pijnappelklier, corticale laag I en resterende weefsel reukkwab weefsel maar het is ook mogelijk om hypofyse weefsel krijgen in het preparaat. Pineal verontreiniging in de MAV wordt gedetecteerd door de MAV met een ronde 1 tot 2 mm diameter bol dat gekleurd donkerrood. De primaire functievan de pijnappelklier wordt normaal beschouwd als volledig verschillend van de MAV. De primaire functie is het produceren van melatonine, dat aspecten van het circadiane ritme 9 regelt, en in lipoxygenation 10 van lipide precursoren. Hoewel het gen Lox, die lipoxygenase activiteit reguleert, werd gedacht dat in volwassenen voornamelijk in de pijnappelklier 10, onze resultaten aan dat het ook consistent aanwezig in grote hoeveelheden in MAV. Overblijvende corticale of reukkwab verontreiniging leidt tot roze baanvormig MAV weefsel met van 1 tot 2 mm dichtere weefsels die veel lichter van kleur ingesloten in. Dit kan worden gezien door "zwevend" de MAV op het oppervlak van de buffer, en vervolgens het zwaardere corticale weefsels of bol met de twee ontleden forceps.
Bij verontreiniging van de MAV van corticale laag Ik weefsel, hypothalamus weefsel of de pijnappelklier aanwezig is, dan is een aantal genen zal een aanzienlijkcant hogere expressie dan wat gewoonlijk in een "schone" dissectie. Verontreiniging van de MAV met pijnappelklier leidt tot hogere expressie van arylalkylamine N-acetyltransferase (AANAT) die nodig is voor melatonine synthese. Helaas, als pijnappelklier vervuiling optreedt tijdens MAV dissectie worden de niveaus van Lox in MAV niet nauwkeurig kunnen worden bepaald. Verontreiniging van de MAV met corticale weefsel leidt tot hogere expressie van neuron-specifieke genen zoals hippocalcin (HPCA), parvalbumine (Pvalb) en / of neuronale pentraxin receptor (Nptxr). Verontreiniging van MAV met hypothalamus weefsel resulteert in de hogere expressie van groeihormoon 1 (GH1), proopiomelanocortin (POMC). In het geval dat enige verontreiniging bestaat in de geoogste weefsels, de meeste van deze genen geïdentificeerd en niet in genexpressieanalyse. Dit is bijzonder belangrijk voor genen in de circulerende blood die nog aanwezig kunnen zijn in MAV of de choroidea plexus.
Interpretting genexpressie gegevens van geoogst MAV en choroidea plexus
De cerebrale oppervlak (oppervlakkige) vasculatuur met de bijbehorende meninges (MAV) en de choroid plexus nodig zijn voor cerebrale bloedstroom en cerebrospinale vloeistof (CSF) homeostase 4,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Het weefsel oogst is geschikt voor biochemische en fysiologische analyse en de MAV is en gevoelig voor schade door amfetamine en hyperthermie 1,2 door genexpressieanalyse. Deze resultaten zijn in overeenstemming is met wat ook bekend is over ernstige hyperthermie en blootstelling aan amfetaminen naar de hersenen vasculatuur in het algemeen 18,19,20. Menselijke klinische gegevens ondersteunen de overtuiging dat de subdurale vasculatuur is gevoelig voor schade door amfetamine en metamfetamine 21,22. Als goed, de grote en kleine cerebrale vasculatures includIng die in de pial laag van de hersenvliezen die worden geoogst in MAV zijn van potentieel hoog belang bij het onderzoek concussive soorten hoofdletsel 23,24 25. De huidige genen expressie profiel verkregen van de MAV geeft aan dat de pial en eventueel de arachnoidea meningeale membranen kunnen een grotere rol spelen dan verwacht in het reguleren van CSF samenstelling. In de toekomst door middel van dissectiemicroscoop technieken is het mogelijk om verder scheiden de weefsels die de MAV zodat de pial en arachnoidea membranen kunnen worden gescheiden van de grotere arteriële vasculatuur huidige en mogelijk van elkaar. Dit resulteert in een betere interpretatie van de functie van elk van deze 3 componenten van de geoogste MAV.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door NCTR / FDA.
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Normal Saline (9 grams saline/ 1 Liter H2O) | In-house | Dissection buffer | |
0.1 M Sodium Phosphate pH 7.4 | In-house | Dissection buffer | |
Bone Rongeurs | Roboz | RS-8300 | Skull bone removal |
Forceps-bent tip (4″ long & 0.8 mm wide tip) | Roboz | RS-5135 or RS-5137 | Dissecting forceps |
Forceps-straight tip (5.5″ long ) | Roboz | RS-8124 or RS-8104 | Thumb Dressing forceps |