Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Optimalisert flekker og spredning modellering Metoder for Celledeling Overvåking hjelp Cell Tracking Fargestoffer

doi: 10.3791/4287 Published: December 13, 2012

Summary

Vellykket bruk av celle sporing fargestoffer for å overvåke immun celle funksjon og spredning involverer flere kritiske trinn. Vi beskriver metoder for: 1) å skaffe lys, jevn, reproduserbar etikett-ing med membran fargestoffer, 2) å velge fluorokromer og datainnhenting betingelser, og 3) velger modell å kvantifisere celleproliferasjon basert på fargestoff fortynning.

Abstract

Fluorescerende celle sporing fargestoffer i kombinasjon med flyt og bilde cytometri, er kraftige verktøy som brukes til å studere samspillet og skjebnene til forskjellige celletyper in vitro og in vivo. 1-5 Selv om det finnes tusenvis av publikasjoner som bruker slike fargestoffer, noen av de mest vanlig forekommende celle sporing søknader omfatte overvåking av:

  1. stilk og stamceller quiescence, spredning og / eller differensiering 6-8
  2. antigen-drevet membran transfer 9 og / eller forløperen celleproliferasjon 3,4,10-18 og
  3. immune regulatoriske og effektor celle funksjon 1,18-21.

Kommersielt tilgjengelige celle sporing fargestoffer varierer mye i sine kjemi og fluorescens egenskaper, men det store flertallet faller inn under en av to klasser basert på deres mekanisme celle merking. "Membran fargestoffer", preget av PKH26, er svært lipofile fargestoffer that partisjon stabilt, men ikke-kovalent til cellemembraner 1,2,11. "Protein fargestoffer", preget av CFSE, er amino-reaktive fargestoffer som danner stabile kovalente bindinger med celle proteiner 4,16,18. Hver klasse har sine egne fordeler og begrensninger. Nøkkelen til deres suksess bruk, særlig i flerfarget studier der flere fargestoffer brukes til å spore ulike celletyper, er derfor å forstå de kritiske spørsmålene som muliggjør optimal bruk av hver klasse 2-4,16,18,24.

Protokollene inkludert her trekke fram tre vanlige årsaker til dårlig eller variabel resultater ved bruk av celle-sporing fargestoffer. Disse er:

  1. Unnlatelse av å oppnå lyse, uniform, reproduserbar merking. Dette er et nødvendig utgangspunkt for enhver celle sporing studien, men krever oppmerksomhet til ulike variabler ved bruk membran fargestoffer enn ved bruk protein fargestoffer eller likevekt bindende reagenser som antistoffer.
  2. Suboptimale fluorokrom kombinasjoner ennd / eller unnlate å inkludere kritiske kompensasjon kontroller. Sporing fargestoff fluorescens er typisk 10 februar til 10 mars ganger sterkere enn antistoff fluorescens. Det er derfor essensielt å verifisere at tilstedeværelsen av sporing fargestoff ikke kompromittere evnen til å oppdage andre prober som brukes.
  3. Unnlatelse av å få en god passform med topp modellering programvare. Slik programvare kan kvantitativ sammenligning av proliferativ respons på tvers av ulike populasjoner eller stimuli basert på forløperen frekvens eller andre beregninger. Innhenting av en god passform, krever imidlertid utelukkelse av døde / døende celler som kan forvrenge fargestoff fortynning profiler og matchende av forutsetningene modellen med egenskapene den observerte fargestoff fortynning profil.

Eksemplene gitt her illustrerer hvordan disse variablene kan påvirke resultatene ved bruk membran og / eller protein fargestoffer å overvåke celleproliferasjon.

Protocol

1. Generell Membran Merking med PKH26 Cell Tracking Dye (Ref. 25, Figur 1)

  1. Bruk steril teknikk for trinn 1.1 til 1.9. Forbered ~ 10 7 humane perifere mononukleære blodceller eller leukocytter (hPBMC, hPBL) ved hjelp av laboratoriets standard metode med tillegg av en endelig 300 xg spin å minimere blodplater forurensning. Resuspender cellene ved 10 7 / ml i HBSS en% BSA og sted på is, reservere en 500 pl alikvot (5x10 6 celler) for bruk i trinn 2.
  2. Plass 5x10 6 celler (500 ul) i en 12 x 75 mm konisk polypropylenrør. Vask en gang med 3,5 ml HBSS. Nøye suge supernatant, uten å etterlate mer enn 15-25 ul restvæsken, men tar seg ikke å fjerne celler. Bruk dette røret for å forberede en 2x cellesuspensjon i trinn 1.4.
  3. Under cellen vaske i trinn 1.2, tilsett 0,5 ml fortynning C merking kjøretøy (fra PKH26GL kit) til en 12 x 75 mm konisk polypropylenrør. Bruk dette røret til preper en 2x PKH26 løsning i trinn 1.5.
  4. Tilsett 0,5 ml fortynning C merking kjøretøy til den vaskede cellepelleten fra trinn 1.2 og aspireres og dispensere 3-4 ganger for å oppnå en enkel cellesuspensjon (2x celler). Unngå bobledannelse og overdreven miksing, noe som kan redusere celleviabilitet og utvinning.
  5. Umiddelbart etter å forberede 2x cellesuspensjon i trinn 1.4, utarbeide en 2x (4 mikrometer) dye løsning ved å legge 2,0 ul på 1,0 mM PKH26 fargestoff lager i etanol (fra PKH26GL kit) til Diluent C tube utarbeidet i trinn 1.3 og vortex til spre jevnt.
  6. Umiddelbart etter å forberede 2x fargeløsning i trinn 1.5, raskt Pipetter 2x cellesuspensjon fra trinn 1,4 til 2x fargeløsning og samtidig aspirer og dispensere 3-4 ganger helt spre celler i fargestoff Ikke:. Legg 1,0 mM fargestoff direkte til celler, hell 2x celler i 2x fargestoff, eller legge 2x celler til 2x fargestoff mens virvle. Fordi farging er nesten momentant, slike metoder gi mindreensartede intensiteter enn den anbefalte metoden (figur 2).
  7. Etter 1 min, tilsett 1,0 ml varmeinaktivert serum eller HBSS 5% BSA for å stoppe fargestoff opptak i cellemembraner. Unnlatelse av å bruke nok protein risikerer dannelsen av fargestoff aggregater, som kan pellet med cellene under vasketrinnene og forårsake utilsiktede merking av andre celler i et eksperiment. Hvis medium med 10% varme-inaktivert serum (CM) eller HBSS en% BSA er å bli brukt til stopp reagens, utføre flekker i et 15 ml konisk polypropylenrør og legge til minst 5,0 ml av stop reagens å sikre adsorpsjon av alt unincorporated fargestoff.
  8. Sentrifuger merkede celler for 5 min @ ~ 400 x g.. Nøye suge supernatanten uten å fjerne celler. Vask pelleten to ganger med 4 ml av CM eller HBSS en% BSA, dispergere pelleten godt før recentrifugation. Å minimalisere overføringen av fargestoff adsorbert på rørvegger og maksimere vaskeeffektiviteten, overføre cellene til en frisk polypropylenrør etter first resuspendering. Merk: tilstrekkelig fargede celler vil oppvise en tydelig rosa skjær i pelleten.
  9. Resuspender vaskede cellepelleten i 1,0 ml HBSS +1% BSA. Tell cellene, bestemme celle utvinning, og justere volumet til å gi en endelig konsentrasjon på 10 7 / ml. Med forsiktig aspirasjon, bør celle utvinning være ≥ 85%. Hvis celle utvinning er <70%, finne årsaken før du fortsetter. Trekke en 150 pl delmengde (1.5x10 6 celler) og plass på isen for bruk i trinn 2.

2. Utarbeidelse av Instrument og Assay Oppsett Controls (tabell 1)

  1. Aliquot 50 ul (5x10 5) av unstained celler fra cellesuspensjonen lagret i trinn 1,1 i hver av fem 1,8 ml Eppendorf-rør: 1, 3, 4, 5 og 7. Aliquot 50 ul (5x10 5) av PKH26 pos celler fra trinn 1,9 i hver av tre rør: 2, 6 og 8.
  2. Tilsett 10 pl IgG blokk (100 ug / tube av IgG, se tabell av reagenser) til rør 1-8og inkuber i 10 minutter ved omgivelsestemperatur (20-25 ° C).
  3. Legge en mette mengde av antistoff (ies) angitt i tabell 1-4 Rør, 5, 7, og 8 og inkuber alle prøvene (Tubes 1-8) i 30 minutter ved omgivelsestemperatur og beskyttet mot lys.
  4. Tilsett 1,5 ml HBSS en% BSA til alle prøver, pellet cellene ved sentrifugering (5 min @ 400 xg) og vask en gang med 1,5 ml HBSS en% BSA, med forsiktig aspirasjon å unngå celletap.
  5. Resuspender hver prøve i 500 ul HBSS +1% BSA. Hvis nødvendig for prøver som skal analyseres på cytometer din, overføre til en 12 x 75 mm rundbunnet rør. Tilsett 10 pl av 100 ug / ml 7-AAD daglig arbeider lager (se tabell av reagenser) til 3 rør, 6, 7 og 8 som angitt i tabell 1. Inkuber på is i 30 min før bruk i strømningscytometer oppsett og farging verifikasjon (trinn 3).

3. Flowcytometer Oppsett og Staining Verifisering

  1. Kontroller at strømmen cytometer fungerer som den skal, ved hjelp av laboratoriets etablerte prosedyrer for daglig kontroll. Kontroller at signaler kan lett påvises i hver spektral vinduet skal brukes, og at detektor-responser er lineært proporsjonal med signalintensiteten i vinduet som skal brukes for spredning overvåking 14.
  2. Erverve FSC vs SSC data for Rør 1 bruker lineære skjerm skalaer. Juster hver enkelt detektor forsterkning slik at lymfocytt befolkningen faller i nedre venstre kvadrant av prikkplott, er ikke off-skala i en av parametrene, og ikke blir avbrutt på grunn av thresholding. Samle ungated FSC vs SSC data for alle prøvene i trinn 3.3 til 3.7.
  3. Samle inn data for Tube 1, med ingen farge kompensasjon og logaritmiske skjerm skalaer for alle 4 fluorescens detektorer. Juster hver enkelt detektor høy spenning (HV) for å plassere autofluorescens av unstained lymfocytter på skalaen med få / ingen celler akkumuleres i første kanal. Angi en analyse grense for hvert histogramtilsvarende til de lyseste 2% av unstained celler.
  4. Bruker ingen fargekompensasjon og HV innstillinger etablert i trinn 3.2 og 3.3, skaffe data for Tube 2, samle FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. For detektoren brukes til å overvåke PKH26 fluorescens, kontrollere at alle PKH26 pos celler vises på skalaen som en enkelt symmetrisk topp i 3. -4 th tiåret, med få / ingen celler i den siste kanalen. Hvis det er flere topper eller topp form er skjev, gjenta trinn 1 med omsorgen for salt minimalisering og miksing teknikk (figur 2). Juster om nødvendig dye konsentrasjon.
  5. Med innstillinger etablert i trinn 3.3, samle inn data for Tube 3, samle FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. For detektoren brukes til å overvåke 7-AAD fluorescens, må du kontrollere at 7-AAD pos celler faller over 2% grenseavtalen i trinn 3.3 (dvs. at ikke-levedyktige celler er godt løstfra levedyktige 7-AAD neg celler).
  6. Med innstillinger etablert i trinn 3.3, samle inn data for Tube 4, samle FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer. Kontroller at CD8 pos celler er godt løst fra unstained celler (dvs. fall over 2% grenseavtalen i trinn 3.3 for FITC detektor). Gjenta med Tube 5 og kontrollere at CD8 pos celler er godt løst fra unstained celler (dvs. fall over 2% grenseavtalen i trinn 3.3 for APC detektor).
  7. Bruke innstillinger etablert i trinn 3.3, samle inn data for 6 Tubes, 7 og 8, samle FSC, SSC og signaler i alle 4 fluorescens detektorer.
  8. Bruk listen modusfiler samlet for Tubes 1-5 og din farge kompensasjon programvare for å etablere en farge overlapper matrise for hver fluorokrom i detektorene blir brukt til å overvåke de tre andre fluorokromer. Påfør denne matrisen til listen modus filen for Prøve 6 og verifisere at tilstedeværelsen av PKH26 labEling endrer ikke muligheten til å oppdage 7-AAD pos celler.
  9. Påfør fargen overlapper matrisen fra trinn 3,8 til listen modus filen for Prøve 7 og verifisere at: a) 3 godt løst subpopulasjoner (CD3 neg CD4 neg, CD3 pos CD4 neg og CD3 pos CD4 pos) kan identifiseres på en FITC vs APC prikkplott, og b) tilstedeværelse av anti-CD3-FITC og anti-CD4-APC endrer ikke evnen til å oppdage 7-AAD pos celler. Dersom tilstedeværelsen av anti-CD3-FITC endrer øvre 2% grense for data innsamlet på PKH26 detektoren, juster grensen som kreves.
  10. Påfør fargen overlapp matrise fra trinn 3,8 til listen modus filen for Prøve 8. Om tilstedeværelsen av PKH26 merking endrer 2% grensen for FITC, 7-AAD eller APC detektorer fra de som er angitt autofluorescens kontroll i trinn 3.3, justere grensen (e) etter behov ved hjelp Tube 7 av tabell 1 og kontroller at den er fortsatt mulig å distinguish CD3 pos CD4 pos, CD3 pos CD4 neg, og CD3 neg CD4 neg celler ved hjelp av den justerte grensen (e).

4. Spredning Model Selection for Celledeling Overvåking av Dye Fortynning

  1. Bestem avstanden mellom generasjoner, som er avhengig av antall kanaler og logaritmiske tiår cytometer din. For digitale instrumenter, er denne verdien, vanligvis 4 eller 5 tiår, bestemmes av antall hyller i digital signalprosessor. På analoge instrumenter, der antall tiår er sjelden et helt tall, krever nøyaktig modellering nøyaktig antall tiår å bli eksperimentelt bestemt. For å gjøre dette, er data fra en blanding av kalibrert fluorescerende perler med produsent-tildelt relative intensiteter kjøpt til den samme detektoren høyspenning innstillingene som brukes i forsøket. Posisjonen til de bead toppene tillater kalibrering av den logaritmiske skala i form av intensity området per log tiår. Konkret gjøres dette ved å plotte kanalnummer for hver perle typen mot stokken av produsenten tilskrives verdi. Stigningstallet en best rett linje som passer for bead dataverdiene gir antall relative intensitet enheter per kanal. Multiplisert med antall kanaler, vil denne verdien deretter være antall log tiår for full skala, hvorfra antallet kanaler som tilsvarer en to-fold reduksjon i intensitet (dvs. datter generasjon linjeavstand) kan beregnes 14.
  2. Bestem om å bruke en fast avstand mellom generasjoner eller å tillate avstandsstykket å flyte. A Standard (fast), vil bruke generasjonsskifte avstand verdi fastsatt i trinn 4,5 til tildele plasseringen av hver generasjon, og brukes vanligvis når histogrammet mangler tydelige topper. En Float innstillingen gjør hver generasjonsskifte topp plassering som fastsettes av histogrammet form og brukes vanligvis når distinguishable generasjonsskifte topper er tydelig.
  3. Bestem om du vil bruke en fast toppbredden for alle generasjoner eller en flytende bredde. Et fast bredde bruker SD beregnet for unstimulated kontrollutvalget å modellere alle generasjoner og er vanligvis valgt når prøven mangler skjelnes generasjonsskifte topper. En flytende bredde gjør at programmet kan uavhengig variere SD for hver generasjon og er best brukt med skjelnes generasjonsskifte topper.
  4. Kjør et program som inneholder en spredning analyse modul (her ModFit LT versjon 3.3). Laste stimulert PKH26 pos fil fra datasettet som skal analyseres (for eksempel en stimulert 96 timer kultur PKH26 pos celler kontrafarget som for Tube 8 i tabell 1).
  5. Velg parameterne for analyse, i dette tilfellet PKH26 (585/42) innkoplet levedyktig (7-AAD neg) CD3 pos lymfocytter og FSC vs SSC å utelukke små rusk og store aggregater (figur 3). I å defineredisse regionene være forsiktig med å inkludere den høye fremover scatter område der blasts er vanligvis funnet og merk at CD3 uttrykk kan være nede-modulert i stimulerte kulturer.
  6. Opprett en ny spredning modell med spredning Wizard. Hjelp av Open datafil (Start tab), legger unstimulated PKH26 pos kontroll fil og definere plasseringen av topp kanal i foreldrenes fordeling tilsvarende udelt celler.
  7. Analysere fil for unstimulated PKH26 pos kontroll, og bemerker verdiene for foreldrenes topp posisjon og bredde (standardavvik). Hvis en fast toppbredden (SD) er ønskelig, sjekk Lås SD.
  8. Laste PKH26 neg kontroll (for eksempel en 96 timers kultur av PKH26 neg celler kontrafarget som for Tube 7 i tabell 1). Juster antall generasjoner ved å innstille peak kanal for dimmest generasjonen ovenfor PKH26 neg kontrollen. Dette bestemmer number av datter generasjoner modellen kan nøyaktig passform og er vanligvis 6-9 generasjoner.
  9. Åpne datafil for stimulert prøve (for eksempel en stimulert 96 timer kultur PKH26 pos celler kontrafarget som for Tube 8 i tabell 1) og kontroller at regionene for foreldrepenger topp plassering og SD som definert i trinn 4.7 uendret. Hvis fast generasjonsskifte avstand er ønskelig, velg Standard modell alternativet, ellers velger Floating alternativet.
  10. Analysere hver eksperimentell fil i datasettet, etter samme modell som er definert i trinn 4.9. Mindre justeringer av foreldrenes topp plassering kan være nødvendig for de aller beste passform som definert både visuelt og ved redusert chi square (RCS) verdi.
  11. Registrere de ønskede spredning beregninger som følge av den best passer for hver eksperimentelle fil i datasettet. For en omfattende beskrivelse av mulige beregninger se Ref. 22.

Representative Results

Membran fargestoffer som PKH26 stain av tilnærmet momentan partisjonering i cellemembraner snarere enn ved kjemisk reaksjon (for CFSE) eller likevekt binding (for antistoffer). Mangel på oppmerksomhet til de kritiske problemer skissert i figur 1 kan resultere i svak eller heterogen farging av typen vist i figur 2. I kontrast, bruk av optimaliserte merking veibane (Figur 1, Tabell 2) resulterer i lyse homogene fordelinger egnet for en rekke av celle sporing søknader inkludert celledeling overvåkning basert på fargestoff fortynning (figur 3). Døde / døende cellene mister varierende mengder sporing fargestoff, som kan utvide og / eller skjeve datter generasjon intensiteter og komplisere spredning modellering basert på dye utvanning 3,4,16,18. Bruk av en levedyktighet fargestoff anbefales derfor ved innsamling dye fortynning data under forhold hvor et betydelig antall døde celler kan forhåndsinnstillesendes, slik som stimulerte kulturer (figur 3) eller eldre prøver (figur 4).

Fordi sporing fargestoff merking typisk gir fluorescensintensiteter flere størrelsesordener større enn immunfenotyping, er det viktig å ta med passende kompensasjon kontroller (tabell 1), og for å verifisere at tilstedeværelsen av sporing fargestoff ikke forringer evnen til å løse antistoff positive og negative celler (figur 4). å unngå behovet for mye farge kompensasjon, er det å foretrekke å plassere et lyst fluorokrom eller en ikke funnet på celler av interesse som et fargestoff utelukket av levende celler, i den spektrale kanal (er) tilstøtende til sporing fargestoff (Figur 4A og B vs. 4C & D). Når du bruker peak modellering programvare for å kvantifisere omfanget av spredning, få en god passform krever matchende forutsetninger innenfor modellen til egenskapene fargestoff fortynning profiles som analyseres (figur 5 og tabell 3). Med passende valg av sporing fargestoffer og levedyktighet reagenser, er det også mulig å karakterisere proliferativ respons i flere lymfocytt subpopulasjoner samtidig. For eksempel, som illustrert i figur 6, forenkler tilsetning av en andre relativ fargestoff diskriminering mellom regulatoriske T-celler (som er merket med CellVue Claret) og høyt proliferated effektor T celler (merket med CFSE) og gir mye større detalj om deres interaksjoner enn kunne oppnås ved hjelp av 3 H-tymidin merking 18,27.

Figur 1
Figur 1. Generell membran merking protokoll for PKH26, PKH67 og CellVue fargestoffer. Partisjonering av disse svært lipofile fargestoffer i celle membranes skjer egentlig umiddelbart etter blanding med cellene når farging er utført i salt-fri Diluent C bil tilgjengelig for å maksimere fargestoff løselighet og flekker effektivitet. Som oppsummert i denne skjematiske for generell membran merking med PKH26, er lys, jevn og reproduserbar farging derfor lettest oppnådd ved: 1) minimere mengder proteiner og / eller salter tilstede i farging trinn og 2) ved hjelp av en blandeteknikk som sikrer rask homogen spredning av cellene i fargestoff (dvs. samtidig eksponerer alle celler til samme konsentrasjon av fargestoff).

Figur 2
Figur 2. Effekt av flekker forholdene på PKH26 fluorescens distribusjoner (gjengitt fra Ref. 18). Repliker prøver av logaritmisk økende, kultivert U937-celler ble farget med PKH26 (sluttkonsentrasjoner: 1 x 10 7 celler / ml, 12 til 15 uM PKH26) i 3 min ved romtemperatur, med eller uten umiddelbar blanding ved tilsetning av 2x celler til 2x fargestoff. Etter vask ble fargede celler analysert på en Beckman Coulter Cyan flowcytometer med konstant instrumentinnstillinger Histogram 1:. Unstained kontroll med PKH26 detektor spenning justert til å plassere alle cellene i målestokk i det første tiåret med få / ingen celler akkumuleres i første kanal. Histogram 2: flekker på 15 mikrometer fargestoff med tillegg av 2x celler til 2x fargestoff med umiddelbar blanding resulterte i en lys, homogent farget, symmetrisk populasjon av celler som er plassert i fjerde tiår, med få / ingen celler akkumuleres i den siste kanalen (gMFI = . 2548, GCV = 26,2%) Histogram 3: flekker på 15 mikrometer fargestoff med tillegg av 2x celler til 2x fargestoff, men uten umiddelbar blanding resulterte i en redusert intensitet og et bredere CV (gMFI = 505 , GCV = 116%), så vel som en svakt farget subpopulasjon, muligens på grunn av et fall av celler utlevert på veggen av røret i stedet for i 2x fargeløsning Histogram 4:. En flekker feil førte til 3 pl konsentrert etanolisk fargestoff stock blir lagt direkte til 2x celler i fortynningsmiddel C uten ytterligere blanding heller enn å bli anvendt for å fremstille en 2x fargeløsning i Diluent C. Dette resulterte i en endelig konsentrasjon på 12 fargestoff uM men ga svært svak og heterogene farging (gMFI = 32,9, GCV = 1020%). Den observerte rett skew mest sannsynlig reflekterer de kombinerte virkninger av: i) dårlig blande grunnet allment uensartet celle og fargestoff volumer, og ii) det faktum at celler som er nærmest fargestoff dispensing punktet ville bli utsatt for en høyere konsentrasjon av fargestoff enn de lenger unna. Klikk her for å se større figur .

re 3 "src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3.jpg "fo: content-width =" 4.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Bruk av en levedyktighet sonde forenkler gating av T celleproliferasjon profiler hPBMC ble merket med PKH26 (endelig cellekonsentrasjon: 3x10 7 / ml; endelige fargestoff konsentrasjon: 10 uM).. Etter kultur i 96 timer i nærvær (stimulert) eller fravær (ustimulert) av anti-CD3 og IL-2, ble celler kontrafarget med anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC og 7-AAD, og ​​ble analysert på en FACSCalibur flowcytometer (se Reference 13 for detaljer). Fargekompensasjon ble utført ved tidspunktet for datainnsamling ved hjelp hardwired kompensasjon krets. Omfanget av spredning ble modellert som beskrevet i trinn 4 med spredning Wizard i ModFit LT3.3. Data fra PKH26 neg kontroll (Tabell 1, Tube 7) er kledde for referanse (grå fylt histogrammer i kolonne 3). Viabilities for unstimulated og STIlerte kulturer var 76% og 62% (ungated data for paneler A og B, henholdsvis). Panel A. PKH26 fargede celler dyrket i 96 timer i middels var gated å inkludere levedyktige (7-AAD neg) CD3 pos celler (R1). I tillegg til antistoffet inkludering og 7-AAD død celle uttrekk gate, en fremre scatter (FSC) versus sidespredning (SSC) porten (R2) ble brukt til å utelukke rusk og tilslag. Merke til fraværet av døde celler i siste plottet i dette panelet. Den beste passform modell for PKH26 spredning profilen (kolonne 3) ga en enkelt topp med RCS = 2.1 (Donor 6, tabell 3), noe som indikerer god symmetri, og ble brukt for å definere posisjon og foreldrenes innkoblingsspiss bredde for analyse av den stimulerte prøve fra dette datasettet (panel B). Panel B. En gjengivelse aliquot av PKH26 fargede celler ble dyrket med anti-CD3 og IL-2 i 96 timer og gated på samme måte som i panelet A. En modell med flytende topp posisjon og flytende toppbredden ga best passer for disse dataene med RCS = 1,3 (Donor 6, tabell 3). Panel C. samme datafil som i panel A ble analysert uten bruk av 7-AAD opplysninger. Når en primær FSC vs SSC ble brukt til delvis ekskludere døde celler og aggregater (R2) og en sekundær gate for å velge CD3 positive hendelser (R3), forble en liten gjenværende populasjon av døde celler (0,2% av gated hendelser). Best mulig passform modell ga en enkel topp med RCS = 2,2. Panel D. Det samme datafil som i Panel B var gated som i Panel C. Legg merke til større gjenværende bestanden av døde celler i stimulert utvalget (1,29% av gated hendelser) for denne gating strategi. Best mulig passform modellen var en med flytende topp plassering og flytende toppbredden (RCS = 1,3). Klikk her for å se større figur .

ig4.jpg "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Effekt av fluorokrom valg og fargestoff konsentrasjon på evne til å immunfenotype lymfocytter merket med PKH26. HPBMC ble isolert fra 24-timers gamle blod og merket med PKH26 som beskrevet i Trinn 1, med det unntak at fargingen ble gjennomført i 12 x 75 mm rundbundet polystyren rør snarere enn 12 x 75 mm koniske polypropylenrør. Umiddelbart etter merking med PKH26 ble cellene kontrafarget med de angitte immunophenotypic og levedyktighet reagenser, og analysert på en LSRFortessa strømningscytometer hjelp gating strategi figur 3A og følgende optisk konfigurasjon: 488 nm laser: FSC-A (488 nm); SSC -A (488/10 BP), FITC-A (530/30 BP); PKH26-A (575/26 BP); 7-AAD-A eller-A PerCP (695/40 BP). 640 nm laser: APC-A eller TOPRO-3-A (670/14 BP). Fargekompensasjon ble utført ved tidspunktet for datainnsamling ved hjelp BD Diva programvare. "Auto"indikerer autofluorescens av nei-antistoff kontroll i den relevante spektral vindu (APC for paneler A og B, PerCP for paneler C og D). Data fra PKH26 neg kontroll (Tabell 1, Tube 7) er kledde for referanse (grå fylt histogrammer, kolonne 5). Post-flekker viabilities var lik for alle prøver (88-92%). Panelet A. Celler merket med PKH26 ved en endelig konsentrasjon på 2 uM ble kontrafarget bruke anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, og 7-AAD ( rør 8 i tabell 3). Etter gating på levedyktig (7-AAD neg) CD3 pos lymfocytter (kolonne 1) og uttrekk av rusk og tilslag basert på FSC og SSC (se figur 3A), ble PKH26 intensitet evaluert i kombinasjon med APC CD4 (kolonnene 2 og 3). Enten ukompensert (kolonne 2) eller kompenseres (kolonne 3), denne fluorokrom kombinasjonen resulterte i god oppløsning mellom CD4 pos T-celler og CD4 neg T celler), som verifisert både av en no-enntibody, autofluorescent kontroll (røret 6 i tabell 1, kolonne 4) og de ​​to-farge plott av CD3 vs. CD4 (kolonne 6). Panel B. Bruke samme fluorokrom kombinasjon som i Panel A, men øker den endelige PKH26 konsentrasjonen til 4 pm ikke påvirke evnen til å løse CD4 pos T-celler fra CD4 neg T-celler. Panel C. A replikere aliquot av cellene uavhengig merket med PKH26 ved en endelig konsentrasjon på 2 uM ble kontrafarget bruke anti-CD3-FITC, anti-CD4-PerCP og TOPRO-3. Etter gating på levedyktige (TOPRO-3 neg) CD3 pos lymfocytter (kolonne 1) og uttrekk av rusk og tilslag basert på FSC og SSC (se figur 3A), ble PKH26 intensitet evaluert i kombinasjon med anti-CD4-PerCP (kolonnene 2 og 3). Betydelige spektral overlapping av PKH26 inn i PerCP kanalen er tydelig i ukompensert data (kolonne 2), og oppløsningen mellom PKH26 pos CD4 pos CD4 neg hendelser er marginal etter at erstatning er brukt (sammenlign kolonne 3 med nei-antistoff, autofluorescent kontroll vist i kolonne 4). Panel D. Når PKH26 konsentrasjon øker til 4 pm, er det ikke lenger mulig å bruke kombinasjonen av fluorokrom Panel C. spektral overlapping fra PKH26 inn PerCP kanalen overskrider intensiteten av signalet fra CD4 (kolonne 2) og CD4 pos PKH26 pos hendelser kan ikke lenger løses fra CD4 neg PKH26 pos T-celler (kolonne 3 vs. Kolonne 4). Klikk her for å se større figur .

Figur 5
Figur 5. Effekt av spredning modell utvalg på. godhet passer for fargestoff fortynning profiler hPBMC ble merket med PKH26 (endelig cellekonsentrasjonen: 3x10 7 / ml; endelig fargestoff konsentrasjon: 10 pM). Etter kultur i 96 timer i nærvær (stimulert) eller fravær (ustimulert) av anti-CD3 og IL-2, celler ble høstet kontrafarget med anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC og 7-AAD og analysert på en FACSCalibur flowcytometer (se Reference 13 for detaljerte metoder). Fargekompensasjon ble utført ved tidspunktet for datainnsamling ved hjelp hardwired kompensasjon krets. Panel A. Den PKH26 intensitet profil fra en 96 timers kultur ustimulert for 5 giver et moderat responder, var gated som vist i figur 3A og brukes til å gi den ModFit Proliferation Wizard med et første estimat av posisjon og bredde for toppen som representerer udelte foreldrecellene. Panel B. Den PKH26 intensitet profilen fra en parallell stimulert 96 hr kultur ble analysert ved hjelp av start anslagene fraPanel A og 4 forskjellige kombinasjoner av 'Proliferation Wizard innstillinger, tilsvarende faste eller flytende peak intensitet, og faste eller flytende peak bredder for etterfølgende datter generasjoner som vist. Som oppsummert i tabell 3, modellen som ga den beste tilpasning til de observerte data (laveste redusert chi-kvadrat; RCS) var den "flytende / flytende" kombinasjon der ikke bare topp posisjoner men også standardavvik av datteren generasjon topper ble tillatt å variere (RCS = 1,5). Samme modell ga best passer for 6 giver en høy responder (Figur 3B og tabell 3).

Figur 6
Figur 6. Tilsetning av en andre celle sporing fargestoff forenkler diskriminering mellom effektor og regulatoriske T-celler i en flowcytometrisk undertrykkelse assay(Tilpasset fra Ref 18.) Monocytt-fratatte lymfocytter fremstilt fra TRIMA leukaferese filtre ble farget med anti-CD127-PE, anti-CD4-PE-Cy7, og anti-CD25-APC og flyt sortert i bestander av effektor (Teff.; CD4 pos CD127 lyse CD25 dim), regulatoriske (Treg, CD4 pos CD127 dim CD25 pos), og tilbehør (CD4 neg) celler. Drevet Treg celler merket med CellVue Claret (endelig cellekonsentrasjonen: 1x10 6 / ml; endelig fargestoff konsentrasjon: 1 mikroM) og sortert Teff merket med CFSE (endelig cellekonsentrasjonen: 5 × 10 7 / ml; endelig fargestoff konsentrasjon, 5 mikrometer) var co-dyrket ved varierende forhold i nærvær av anti-CD3, anti-CD28 og bestrålt aksessoriske celler. Etter 96 timers, kulturer ble høstet, kontrafarget med anti-CD4-PE-Cy7 og LIVE / DEAD Fixable Violet, og analysert på en LSRII strømningscytometeret og farge kompensasjon ble utført på den tiden av data OPPKjØPn bruke BD Diva programvare (se Reference 18 for detaljer inkludert kompensasjon kontroller). Spredning indeksene for Teff og Treg ble modellert som beskrevet i trinn 4, ved hjelp av spredning Wizard i ModFit LT3.3. Datapunkter i paneler B og C representerer middelverdien ± 1 standard avvik av triplikate prøver panelet A. Representative data er vist for en av tre triplikate prøver i Treg:. Teff forholdet 0.25:1. LIVE / DEAD Fixable Violet reagens ble brukt til å utelukke døde celler (R1, øverst til venstre tomt, tilbehør celler = rød-brun, ikke-levedyktig Teff = grå og levedyktig Treg = rød) fra alle andre data plott. CellVue Claret farging ble brukt til å skille levedyktig Treg (R4, til høyre for midten tomt, blå) fra levedyktig, men svært proliferated Teff (R5, til høyre for midten tomt, grønn). En enkelt parameter CFSE spredning profil for Teff (nedre venstre tomt) ble generert av gating på celler som var CFSE pos (R5), CD4 pos (R3), levedyktig (ikke R1), og hadde lymfocytt scAtter egenskaper (R2). En enkelt parameter CellVue Claret spredning profil for Treg ble generert av gating på celler som var CellVue Claret pos (R4), CD4 pos (R3), levedyktig (ikke R1), og hadde lymfocytt scatter egenskaper (R2). Legg merke til den sjenerøse lymfocytt regionen (R2) er definert til å omfatte lymfocytt blasts. Merk også at antall celler som skal samles avhenger den laveste frekvensen populasjonen. I en celleproliferasjon eksperiment hvor befolkningen av interesse kan være fordelt over et bredt spekter av intensiteter representerer inntil syv eller åtte generasjoner et stort antall celler skal samles for å nøyaktig modellere og beregne antall celler i hver generasjon. Når studere sjeldne celler, kan det være nødvendig å bare kjøre prøverøret nesten tørr for å samle størst mulig antall hendelser. For prøven vist her, gjør dette resulterte i totalt ~ 25000 hendelser, hvorav 11 923 var Teff (Proliferation jegndex 3,85) og 1380 var Treg (Proliferation Index 1,83). Panel B. Som forventet å øke andelen Tregs stede i co-kulturer førte til større undertrykkelse av Teff celleproliferasjon. Lignende resultater ble oppnådd med både CellVue Claret-farget (heltrukket linje) eller unstained (stiplet linje) Treg, noe som indikerer at farging med CellVue Claret sporing fargestoff ikke påvirke Treg potens. Panel C. Treg er relativt anergic og som forventet, gjorde ikke spre når inkubert med anti-CD3, anti-CD28, og tilbehør celler i fravær av teff celler (Treg: Teff forholdet 1:0). Men som andel av Teff stede i co-kulturer økt (dvs. som Treg: Teff ratio redusert), omfanget av Treg spredning også økt. De generelt større feilfelt for disse dataene i det minste delvis reflekterer den begrensede grad av spredning, som fører til mindre antall hendelser innsamlet forhold til Teff og større usikkertty i modellering antall celler i hver generasjon. Klikk her for å se større figur .

Tube Nei (Formål) PKH26 Antistoff (er) 7-AAD
1 (Setup, kompensasjon) - - -
2 (Setup, kompensasjon) + - -
3 (Setup, kompensasjon) - - +
4 (kompensasjon) - CD8-FITC b -
5 (kompensasjon) - CD8-APC b -
6 (no Ab kontroll) + - +
7 (Ingen sporing dye controll) - CD3-FITC CD4-APC eller CD19-APC c +
8 (T0 kontroll) + CD3-FITC CD4-APC eller CD19-APC c +

. Tabell 1 Instrument Setup styrer en en Styrer oppført er passende for en 4-farge CD4 T celleproliferasjon overvåking analysen med:. PKH26 (spredning fargestoff), CD3-FITC (pan-T celle markør), CD4-APC (T-hjelper celle markør), 7-aminoactinomycin D (7-AAD, død celle eksklusjon) b Brighter surrogater for CD3-FITC og CD4-APC (bedre evne til å oppdage kompensasjon feil) c Figur 3:.. CD3-FITC og CD19-APC. d Fig. 4: CD3-FITC og CD4-APC.

Celletype Endelig Cell Konsentrasjon Endelig Dye Konsentrasjon </ Strong> Referanse
hPBMC b 1 x 10 7 / ml 2 mikrometer PKH67 10,17
5 x 10 6 / ml 2 mikrometer PKH26 12
3 x 10 7 / ml 10 mikrometer PKH26 13
5 x 10 7 / ml 30 mikrometer PKH26 18
1 x 10 6 / ml 1 pM CellVue Claret c 18
3 x 10 7 / ml 4 pM CellVue Claret 13
5 x 10 7 / ml 5 mikrometer CellVue Claret 18
Celler i kultur 5 x 10 5 / ml 0,1 mikrometer PKH26 (1 ° mammary celler) 8
1 x 10 7 / ml 15 mikrometer PKH26 (U937) 18
1 x 10 7 / ml 12,5 -15 mikrometer PKH26 (U937) 15
1 x 10 7 / ml 1 mikrometer PKH67 (K562) 18
1 x 10 7 / ml 1 pM PKH67 (T cellelinjer) 9
1 x 10 7 / ml 10 pM CellVue Claret (YAC-1) 23

Tabell 2. Non-perturbing Membran-Dye Farging betingelser en. En tilpasset og oppdatert fra Ref. 18 år. B En lav hastighet vask (300 xg) ble brukt for å minimere blodplater forurensning. C Treg celler (flyt sortert CD4 pos CD25 pos CD127 neg lymfocytter).

<td> 4,5
Modell Innstillinger modellresultatene
Donor Behandling Peak posisjon SD Parental posisjon Parental SD Ant. Peaks Montert RCS PI PF
5 Unstimulated Float Float 209 4.5 1 5.1 1.0 0
5 Stimulert Fast Fast 209 7 35 3.9 31
5 Stimulert Float Fast 209 4.5 8 19 4.3 30
5 Stimulert Fast Float 209 9.2 6 1.9 3.8 30
5 Stimulert Float Float 209 9.0 7 1.5 3.7 29
6 Unstimulated Float Float 205 4.0 1 2.1 1.0 0
6 Stimulert Fast Fast 205 4.0 6 42 6.6 60
6 </ Td> Stimulert Float Fast 205 4.0 7 12 7.4 60
6 Stimulert Fast Float 205 8.6 6 6.9 6.8 62
6 Stimulert Float Float 205 6.5 6 1.3 6.5 59

Tabell 3. Impact of spredning Model på godhet av Fit (RCS) og spredning Metrics en. Et eksempel farging, datainnsamling og gating som beskrevet i figur 3A & B.

Discussion

Metodene beskrevet her er de som finnes i våre kombinerte laboratorier til mest pålitelig gi optimale resultater for hPBMC merking med membran fargestoffer 13,16,18 og for lymfocytt subset fenotyping og spredning sporing ved hjelp av enten membran eller protein fargestoffer 2,11,13,16, 18 år. Som illustrert i figur 1 og 2, er lyse ensartet merking lettest oppnås ved å begrense tilstedeværelsen av fysiologiske salter og ved hjelp av en blanding teknikk som fører til hurtig, homogen eksponering av alle celler til samme konsentrasjon av fargestoff. Fordi farging med membran fargestoffer skjer ved partisjonering i lipid bilayer, kan andre variabler som endrer gratis dye konsentrasjon også påvirke merking effektivitet. For eksempel, merking i rundbunnet polystyren rør resulterer i mindre effektiv utvasking av salter før resuspensjon i Diluent C og også i redusert fri fargestoff konsentrasjon på grunn til fargebad adsorpsjon på rørvegger, særligved lavere fargestoff konsentrasjoner. Begge faktorer har en tendens til å gi flekker bredere fordelinger enn når merking er gjort ved hjelp av konisk bunn polypropylenrør (figurene 3, 4 og upubliserte resultater). Sample alder og type kan også påvirke toppbredden selv når optimaliserte flekker prosedyrer brukes. For eksempel CV for PKH26 pos lymfocytter isolert fra ferske trukket blod varierer fra 14-20% (figur 3, Ref. 13 og upubliserte resultater), mens CV for lymfocytter isolert fra 24 timers gamle blodprøver eller TRIMA pheresis filtre utvalg 25-30 % (figur 4 og Ref. 18).

Flekker ensartethet og i hvilken grad ikke-levedyktige celler kan utelukkes fra analyse både påvirke om skjelnes datter toppene er tydelig i fargestoff fortynning profilen, som i sin tur påvirker valg av en spredning modell å passe de observerte data (figur 5 og 6 (figur 3, 5 og 6, Tabell 3), andre programvarepakker også inneholde moduler for å analysere spredning data. Disse inkluderer FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) og FlowJo (Tre Star, Inc., Ashland, OR). Alle disse programmene bruker en ikke-lineær minste kvadraters analyse for å iterativt finne den best passer til rådata ved å endre posisjon, høyde og SD (eller bredde) Gaussian topper representerer sekvensielle datter generasjoner. Proliferativ Indeks (PI) og Precursor Frekvens (PF) er de mest brukte tiltak av omfanget av spredning. PI, som definert av ModFit, er et mål på økningen i celletall løpet av analysen, analogt med det 'stimulering indeks' av en tymidin opptak assay. PF returnerer brøkdel av celler i den innledende population som svarte på stimulans ved proliferating. Forsiktighet anbefales, men når du leser litteratur siden terminologi varierer noe mellom programvarepakker (f.eks FlowJo og ModFit bruker forskjellige definisjoner og beregninger for hva som menes med "Proliferation Index") 22.

De kritiske spørsmålene diskutert her for merking og spredning analyse med membran fargestoffer er også oppstått ved bruk protein fargestoffer. For eksempel, må spesiell oppmerksomhet for blandeteknikk også observeres, sammen med uttrekk av døde / døende celler, for å oppnå ensartede distribusjoner og skjelnes datter topper ved bruk CFSE (figur 6) 2-4,13,18,24. Riktig valg av fluorokromer for fenotyping og levedyktighet vurdering er også viktig å unngå overdreven spektral overlapping og manglende evne til å gjenkjenne antistoff positive celler, særlig med synlige utslipp protein fargestoffer som CFSE 2-4,11,13,16,18 (figur 6). Til slutt, selv membran fargestoffer generelt en tendens til å utvise mindre toksisitet 11,26, er det mulig å over-label celler med enten klasse av fargestoff. Det er derfor alltid nødvendig å verifisere at konsentrasjonen av sporing fargestoff som brukes ikke har endret funksjonaliteten av cellene som skal spores (figur 6) 3,13,16,18.

Disclosures

K. Humphrey, JD Tario, Jr og PK Wallace har fått pre-kommersielle celle sporing reagenser for evaluering fra Life Technologies, Inc. og BD Biosciences. AD Bantly og JS Moore har fått pre-kommersielle celle sporing reagenser for evaluering fra Life Technologies, Inc. og finansiering fra PTI Research, Inc. for pre-kommersiell karakterisering av ulike CellVue celle sporing fargestoffer. K. Muirhead er ansatt SciGro, Inc., som tilbyr konsulenttjenester til Phanos Technologies, Inc. (eier av PKH og CellVue fargestoffer) og gir backup teknisk støtte for Sigma-Aldrich og molekylær Målretting Technologies, Inc. (distributører av disse fargestoffer).
Produksjon og fri tilgang til denne artikkelen er sponset av Sigma-Aldrich.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker spesielt å takke følgende personer for deres tekniske og intellektuelle bidrag til utviklingen av disse metodene gjennom årene: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science and PTI Research) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), og Mary Waugh (Dartmouth Medical School). De vil også gjerne takke Bowdoin klassen av 2006 fra den årlige kurs i forskningsmetode og anvendelser av flowcytometri, som genererte data vist i figur 2.

Flowcytometri ble utført ved Roswell Park Cancer Institute flowcytometri Laboratory, som ble etablert i en del av utstyr tilskudd fra NIH Delt Instrument Program, og får støtte fra Core Grant (5 P30 CA016056-29) fra NationalCancer Institute til Roswell Park Cancer Institute, og på Abramson Cancer Center flowcytometri og Cell Sortering Resource Laboratory ved University of Pennsylvania, som ble etablert i en del av utstyr tilskudd fra NIH Delt Instrument Program, og får støtte fra NIH # 2P30 CA016520 fra National Cancer Institute. Arbeidet er vist i figur 3 og 5 ble også støttet delvis av SBIR stipend EB00228 fra National Institutes of Biomedical Imaging og bioteknologi (NIBIB) tildelt PTI Research, Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Commercially Purchased
7-Aminoactinomycin D Sigma-Aldrich A9400
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
Hanks balanced salt solution (HBSS) Life Technologies 14175-079 Calcium and magnesium free, without phenol red
Human IgG Cohn fraction II and III globulins Sigma-Aldrich G-4386
Mouse anti-human CD3-FITC BD Biosciences 349201 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD4-APC BD Biosciences 340672 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD4-PECy7 BD Biosciences 348799 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD8-FITC BD Biosciences 347313 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD8-APC Caltag (Life Technologies) MHCD0805 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD19-APC Caltag (Life Technologies) MHCD1905 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD25-APC BD Biosciences 340938 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD127-PE BD Biosciences 557938 Saturating concentration as determined by laboratory titration
Mouse anti-human CD3 eBiosciences 16-0037-85 1.0 mg/mL; azide free
Mouse anti-human CD28 eBiosciences 16-0289-85 1.0 mg/mL; azide free
PBS Gibco 21300-058
PKH26 red fluorescent cell linker kit containing 10-3M PKH26 in EtOH and Diluent C Sigma-Aldrich PKH26GL-1KT
or
MINI26-1KT
Procedures in Step 1 also apply to kits containing PKH67 or other CellVue dyes
CellVue Claret far red fluorescent cell linker kit containing 10-3M CellVue Claret in EtOH and Diluent C Sigma-Aldrich MINCLARET-1KT or MIDCLARET-1KT
5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE) Invitrogen (Life Technologies) C34554 Non-fluorescent; cleaved by membrane esterases to form fluorescent amino-reactive carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)
LIVE/DEAD Fixable Violet Invitrogen (Life Technologies) L34955
Sterile 12x75 mm conical
polypropylene tubes & caps
VWR 60818-102 Gives better membrane dye staining efficiency (reduced dye adsorption; less cell loss during supernatant aspiration)
12x75 mm round bottom
polystyrene tubes
Becton Dickinson 21008-936
Flow cytometer BD Bioscience FACSCalibur
LSRFortessa
Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567nm, and 655nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660nm)
Flow cytometer Beckman Coulter LSRII CyAn Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567nm, and 655nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660nm)
Laboratory Prepared
7-Aminoactinomycin D,
concentrated stock
NA NA 1 mg/mL in PBS. Freeze in aliquots and store at -20 °C.
7-Aminoactinomycin D,
working stock
NA NA 100 μg/mL in PBS; prepare daily from 1 mg/mL frozen stock.
IgG block NA NA HBSS + 10 mg/mL Human IgG Cohn fraction II and III globulins + 10 mg/mL BSA.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A. Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function. Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. Diamond, R. A., DeMaggio, S. Springer-Verlag. New York, NY. 302-352 (2000).
  2. Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications. Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).
  3. Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).
  4. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  5. Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques. J. Immunol. 184, 303-314 (2010).
  6. Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties. Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).
  7. Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy. Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).
  8. Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content. Cell. 140, 62-73 (2010).
  9. Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fournié, J. -J. Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells. Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).
  10. Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen. J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).
  11. Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells. Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).
  12. Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF). Prostate. 66, (6), 667-674 (2006).
  13. Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation. Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).
  14. Givan, A. L. A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation. Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).
  15. Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation. Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).
  16. Wallace, P. K., Tario, J. D. Jr, Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., ,, Muirhead, K. A. Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution. Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).
  17. Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival. Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).
  18. Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry. Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).
  19. Fuse, S., Underwood, E. Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry. Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).
  20. Schütz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells. Blood. 111, 3546-3552 (2008).
  21. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).
  22. Roederer, M. Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian. Cytometry. 79A, 95-101 (2011).
  23. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).
  24. PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kits for General Cell Membrane Labeling [Internet]. Sigma-Aldrich. Available from: http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/mini26bul.Par.0001.File.tmp/mini26bul.pdf (2012).
  25. Houlihan, D. D., Newsome, P. N. Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease. Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).
  26. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory. T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).
Optimalisert flekker og spredning modellering Metoder for Celledeling Overvåking hjelp Cell Tracking Fargestoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tario Jr., J. D., Humphrey, K., Bantly, A. D., Muirhead, K. A., Moore, J. S., Wallace, P. K. Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287, doi:10.3791/4287 (2012).More

Tario Jr., J. D., Humphrey, K., Bantly, A. D., Muirhead, K. A., Moore, J. S., Wallace, P. K. Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287, doi:10.3791/4287 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter