Summary
这里所描述的方法采用直接注射昆虫病原细菌进入血淋巴
Abstract
烟草天蛾 ，俗称烟草天蛾，被认为是一种重要的农业害虫，取食茄科植物，包括烟草和番茄。的敏感性M.烟草天蛾幼虫，各种昆虫病原细菌物种1-5，以及丰富的信息提供有关昆虫的免疫系统6-8，悬而未决的基因组序列9它一个很好的模式生物用于研究宿主-微生物相互作用在发病机制。此外，M.烟草天蛾幼虫是比较大，且易于操作，并在实验室中保持相对于其他易感昆虫物种。他们的大尺寸也有利于有效的组织/血淋巴的提取分析宿主对感染的反应。
这里介绍的方法描述了直接注射的细菌进入血淋巴（血腔） 的影响烟草天蛾幼虫。这种方法可以使用各种细菌菌种，菌株，或突变体，通过简单地监测昆虫死亡的时间注射后的毒力特性进行分析和比较。这种方法的开发研究的致病性嗜和 Photorhabdus物种，通常与线虫载体为手段，以获得进入昆虫的。通常感染昆虫病原线虫幼虫通过自然的消化系统和呼吸系统的开口，并释放它们的共生细菌进入昆虫血淋巴（血），此后不久，10。这里描述的注射方法绕过需要为线虫矢量，从而脱开细菌和线虫的效果上的昆虫。此方法允许精确枚举传染性物质（细胞或蛋白质）内的接种物，这是不可能使用其他的现有的方法，用于分析entomopathogenesis，包括刻痕11和经口毒性实验12 这里所描述的直接注射法的效用是，分析细菌致病通过监测昆虫死亡率。然而，该方法可以很容易地被扩展用于分枝杆菌感染的影响研究天蛾免疫系统。这种昆虫感染的反应通过体液免疫和细胞反应。的体液应答包括确认细菌相关的模式和各种抗微生物肽的后续生产7编码这些肽的基因的表达，可以监测直接感染后，通过RNA的提取和定量PCR 13。涉及瘤细胞对感染的反应，封装和血细胞吞噬作用的传染性病原体的6 13日，14。
Protocol
1。昆虫卵的消毒和饲养
- 准备由第一高压灭菌15克所提供的琼脂的饮食在900-1,000毫升H 2 O。立即高压灭菌后，拌入166克小麦胚芽饮食和融合，以及在实验室搅拌器。倒入一盘菜（菜）冷却，然后将其转移到铝箔的饮食，包裹得紧紧的，储存于4°C。
- 抵达后，消毒M.天蛾鸡蛋与250毫升0.6％的漂白剂溶液的玻璃过滤器托架和真空烧瓶装置用一个90毫米的滤纸，偶尔搅拌2-3分钟。
- 打开真空漏极与250毫升无菌蒸馏H 2 O每洗涤漂白剂溶液和洗涤鸡蛋3-4倍。
- 将鸡蛋新鲜90 mm的滤纸放在一个培养皿盖子，并允许他们干，直到他们不再粘在一起（约20-30分钟）。
- 塑料容器的底部与传送鸡蛋昆虫饮食，在每个容器中放置约40蛋（ 图1A）。鸡蛋分开饮食，以防止水分引起的真菌污染。保持在26°C的鸡蛋，一个16小时光照：8小时黑暗的光照。鸡蛋会减轻到黄白色，孵化前的。
- 当孵化完成后，仔细约25幼虫转移到新的容器与饮食的底部（ 图1B）。重要的是要拿起黑色的长角，使用产钳，以避免伤害他们，在他们脆弱的早期发育阶段的每个幼虫。孵育2天作为以上。虽然在这个阶段，幼虫死亡是不寻常的一些死，或者更可能的是，幼虫发育发育不良。这种昆虫应该被排除在进一步的研究和牺牲冻结。
- 为了避免吃人的行为，转移幼虫到单独的容器中，用小块的食物（ 图1C）和孵化如上。监测昆虫生长发育，更换食物和清洁的粪便欧t的容器每隔一天，直到他们接受第三幼虫蜕皮（通常为6-9天孵化后）。这是第 4龄幼虫期，其特征在于，在每个的前脚和增加突出的条纹沿昆虫体（ 图1D）的外观黑色钩状crochets的。幼虫的大小有很大的不同，但0.15-0.4克的重量通常在进入4 龄阶段。幼虫的类似大小应选择用于注射。
2。制备注射液的细菌
- 成长的细菌菌株（S）的增长阶段，你想测试的标准程序进行测试。
- 通过纺丝，在室温下以13,000 rpm离心2分钟，在要测试的粒料500μl的每个菌株。
- 悬浮细胞在1毫升无菌1倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）和颗粒再次如上。
- 悬浮细胞在0.5毫升无菌1×PBS和测量确定光学密度（OD）的悬浮液。稀释所有的悬浮液，以同样的OD，如果必要的话。细胞再悬浮和代替的1x PBS稀释无菌生长培养基也可能被用于，如果需要的话。
3。注射第 4龄幼虫
- 准备串行的10倍稀释液的第一菌株在6个孔的96孔微量滴定板在无菌的1×PBS中，使用新鲜的移液管尖，每个稀释度（ 图2A）。各孔中的细胞悬浮液的最终体积应超过所需体积的注射（10微升按每昆虫）加20微升板的接种物（见步骤3.2和3.7）。
- 现货各10微升含有适当的生长培养基中的Petri板沿顶部5稀释液（10 -2至10 -6）。倾斜板，使斑点分布的中心（ 图2B）。
- 在容器中删除昆虫的饮食，粪便和地方的昆虫冰约5分钟。
- 消毒的注射器针头，通过漂洗3次，每次2管的70-100％乙醇中，然后由一个管的无菌，H 2 O的 （ 图2C）。的液体的体积必须是足以淹没针。
- 定量稀释细胞悬浮液，在显微镜下，使用血细胞计数器。根据所需的接种物，得出10微升从适当的微量滴定孔（ 图2D）。
- 棉签昆虫表面用95％乙醇，并注入10毫升细胞悬浮液中，以一个角度（小于45°）进入昆虫背后的一个腹部前腿。请注意，不要穿刺肠道注入的的内容正下方的表皮细胞层（ 图2E）。虽然有些损失是正常的血淋巴（清晰，绿色 - 蓝色的液体），颗粒物和黄色液体从注射部位出现表明肠道穿刺。如果发生这种情况，牺牲的昆虫，并重新获得一个新的幼虫把它。
- 在第一次注射组，对其余每个昆虫，重复步骤3.6。针灭菌注射相同的稀释和细菌菌株的每个昆虫，除非发生污染之间是没有必要的。或者，可以使用的重复分配器在样品注射体积之间的更大的一致性。
- 注入每个昆虫与第一应变的细菌后，重复步骤3.2，这一次发现的细胞悬浮液在板的中间，并让他们朝下方流动（ 图2F）。孵育板在适当的温度和算殖民地枚举接种。该第二电镀工序是用来验证样品在注射过程中不被污染，因为这会导致完全不同的集落数之间的第一和第二镀层。
- 重复步骤3.1至3.8，在实验中对每种菌株的细菌。最后，注入3-5昆虫不育1X PBS使用STER异亮针作为阴性对照组。在26°C温育昆虫，一个16小时光照：8小时黑暗的光照。
- 随着时间的推移，注射后监测昆虫的生存。昆虫死亡的特点是刺激后，由于缺乏自主性运动。昆虫往往表现出食欲不振，腹泻（水样便，黄色的粪便），和/或水的损失（“出汗”）在感染过程中死亡前，这些特征可能是值得一提的还有。
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Representative Results
是图3中所示的昆虫死亡率测定的代表性示例。在这个实验中，与约50菌落形成单位（CFU）的野生型（ATCC19061）或减毒的突变株（LRP 13）， 嗜线虫致病杆菌的生长中期日志相组（n = 6昆虫每株）昆虫注射。昆虫观察到约72小时，和记录在每个时间点％注入昆虫还活着。在这种情况下，弱毒株呈明显的延迟杀虫，野生型菌株注射后30小时内杀死了所有6幼虫之前，任何突变体感染的幼虫死亡。
图1。昆虫饲养中的注射剂。 A）约40表面消毒的鸡蛋被放置在5盎司杯的底部昆虫不育饮食休息上的橡胶塞。乙）第二十新孵化的昆虫被转移到5盎司杯的底部上的昆虫不育的饮食，并培养2天。 C）下一个传输昆虫单独1盎司杯的底部，用无菌饮食和培养，直到他们成熟。四龄M. D） 烟草天蛾幼虫与突出的条纹沿着身体（顶部）和黑色crochets上腹部前腿（底部）。
图2 4 龄 M. 注射 烟草天蛾幼虫。 A）的连续稀释细菌在96孔板中。 B）10微升的多个稀释镀到枚举接种。 C）的注射器灭菌用3在乙醇（2x）和无菌水漂洗。 D）从适当的稀释液被吸取到注射器10微升。 E）将细胞悬浮液以45°的喷射后面的第一个腹部前脚的角度。 F）的稀释液再次镀的接种物，以提供第二措施。
图3代表 M 的结果天蛾注射法。了约50个菌落形成单位（CFU）的固定相（10微升从稀释10 -4）中的嗜线虫致病杆菌细胞注入6 4 龄 M.每株烟草天蛾幼虫。野生型和与一个已建立的毒力缺陷的突变菌株（LRP）被注入和监测的昆虫死亡率随着时间的推移。结果以％存活的昆虫，随着时间的推移（以小时计）。这些曲线是统计学上的不同，一个P值为0.000458，通过对数秩分析。
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Discussion
直接注入M.烟草天蛾幼虫与昆虫病原细菌，如这里描述的，作为一个简单的和有效的手段来分析细菌的毒力。的方法，还具有很高的适应性，以适应不同的实验对象和/或条件。细菌可以在注射之前，以各种方式来制备。在X的箱子线虫 ，野生型细胞生长在营养丰富的Luria-Bertani（LB）培养基中对数期通常是最致命的，注射后30小时内杀死了大部分或所有的昆虫。固定相的细胞通常需要5-10小时更长的时间来杀死幼虫。虽然生长阶段影响毒力，注入细胞总数的似乎是不太重要的， 如图16所示 ，与典型的接种物范围从20到20000 CFU。事实上，在致病杆菌和 Photorhabdus物种的情况下，尽可能少为5 CFU足以杀死昆虫的主机17。为了评估的毒力prope乙醇灭菌（ 如芽孢杆菌 ）有抗性的细菌物种rties，一次性针头可用于注入代替乙醇灭菌（步骤3.4）中的每一个独特的应变。
这种方法的进一步调整可能会涉及修改饲养和/或操纵M.天蛾。例如，昆虫可能被饲养在番茄或烟叶作为更天然食物来源。另外，不同发育阶段的M.通过该方法，可以测定烟草天蛾幼虫 。四龄幼虫选择根据他们的规模比较大，但较小的幼虫也可通过这种方法被注入。第五龄幼虫可以被注入，但在此阶段的发展使免疫系统的变化晚第 5龄幼虫比第 5 次初龄幼虫18更容易，可能复杂数据分析。
最后，直接注入方法可适于用于与其他种类的昆虫。M.天蛾作为一个模型主机高致病性物种，因为它是更不容易受到感染，更容易比其他模式生物，如大蜡螟。G.可注入蜡螟记载的方法在本工作19，然而，可能是有用的测定比致病杆菌和 Photorhabdus物种毒性较弱的细菌物种。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢古德里奇布莱尔实验室的前任委员：萨曼莎乌节路，金佰利考尔斯，艾琳·赫伯特陈，格雷格·理查兹，梅根·梅纳德，YOUNGJIN园为发展本协议所作出的贡献。这项工作是由美国国家科学基金会的资助IOS-0950873和美国国立卫生研究院NRSA奖学金FAI084441Z。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375" length, point style 2 |
References
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