Summary
الزرد الفقاريات تمثل نموذجا القوية التي كانت غير مستغلة للدراسات التمثيل الغذائي. نحن هنا وصف وسيلة سريعة لقياس
Abstract
وثمة هدف نموا في مجال التمثيل الغذائي هو تحديد تأثير الوراثة على جوانب مختلفة من وظيفة الميتوكوندريا. وفهم هذه العلاقات تساعد على فهم المسببات الكامنة وراء مجموعة من الأمراض المرتبطة مع ضعف الميتوكوندريا، مثل السكري والسمنة. التطورات الحديثة في الأجهزة، وتمكين رصد المعلمات وظيفة الميتوكوندريا متميزة في خطوط الخلايا أو الأنسجة إإكسبلنتس. هنا نقدم طريقة لتحليل السريع وحساسة من المعلمات وظيفة الميتوكوندريا في الجسم الحي خلال التنمية الجنينية الزرد باستخدام فرس البحر العلوم البيولوجية XF 24 محلل تدفق خارج الخلية. يستخدم هذا البروتوكول لقطة جزيرة microplates حيث يتم وضع الجنين واحد في كل بئر، مما يسمح للقياس الطاقة الحيوية، بما في ذلك: (ط) التنفس القاعدية، (الثاني) التنفس الميتوكوندريا القاعدية (الثالث) التنفس الميتوكوندريا بسبب دوران ATP، (الرابع) الميتوكوندريا فكت التنفس أو العلاقات العامةأطأن تسرب و(رابعا) الحد الأقصى التنفس. يمكن استخدام هذا النهج التنفس الزرد الجنينية يمكن مقارنة بين المعلمات نوع البرية والأجنة المعدلة وراثيا (متحولة، الإفراط في التعبير الجيني أو ضربة قاضية الجين) أو تلك التلاعب دواء. من المتوقع أن نشر هذا البروتوكول سوف توفر للباحثين مع أدوات جديدة لتحليل الأسس الجينية للاضطرابات التمثيل الغذائي في الجسم الحي في هذا النموذج الحيواني الفقاريات ذات الصلة.
Protocol
الجزء 1: المعالجة الكيميائية للالأجنة الزرد
- جمع الأجنة الزرد بعد الإخصاب. احتضان 28.5 ° C في المتوسط في E3 في 100 × 15 ملم أطباق بتري ملاحظة: للفي الموقع التهجين أو النفط تلطيخ-O الأحمر، يتم إضافة 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU) في تركيز النهائي من 0.2 مم إلى تمنع تشكيل الصباغ، 1 ولكن ليس من الضروري لتحليل فرس البحر.
- الدراسات الدوائية، إضافة الكيميائية المطلوبة في التركيز على النهائي المناسبة لتطوير الأجنة الزرد في حوالي 26 ساعة الإخصاب آخر (HPF) مع ملاحظة السيارة فقط المكافحة المناسبة: لحساسة للضوء مثبطات الدوائية، يمكن أن يسمح لتطوير الأجنة في وقبل الظلام لتحليلها.
الجزء 2: لايف الشخصي الأيض باستخدام فرس البحر XF 24 محلل
- قبل كل تشغيل، وفرس البحر XF خرطوشة محلل ال 24 التي تضم H 2 O و
- إعداد لوحة XF 24 جزيرة جيدا 24. يعمل التسلسل التالي التجريبية:
- منذ استهلاك الأكسجين حساسة للتقلبات درجة الحرارة، وتستخدم أربعة آبار للسيطرة على تقلبات درجات الحرارة ممكن عبر اللوحة. هذه الآبار لا تحتوي على أجنة، ولكن تمتلئ مع 700 ميكرولتر من E3 المتوسطة (الشكل 2A).
- تمتلئ المتبقية 20 بئرا (انظر الجزء 2.2) مع 700 ميكرولتر من E3 المتوسطة وجنين واحد كل (2B الشكل).
- لكل تجربة، ومعالجة 10 الأجنة مع السيارة فقط (التحكم) و 10 تعامل مع مثبط الكيميائية (المعالجة). وتناوبت السيطرة والمعالجة الأجنة (مثل جيدا A2: جنين السيطرة؛ A3 جيدا: الجنين المعالجة: A4 جيدا: جنين السيطرة؛ جيدا A5 الجنين المعالجة، الخ).
- يضاف شاشة التقاط جزيرة على رأس. كل بئر لضمان أن تبقى العينة في غرفة القياس في جميع أنحاء مقايسة (الشكل 2B) ملاحظة: المعالجة كيميائيا الأجنة البقاء مع حلها الكيميائية الأصلية في جميع أنحاء الإجراء بأكمله، ولا حاجة لتغسل المادة الكيميائية قبل تشغيل محلل فرس البحر البرنامج.
- الانتهاء مرة واحدة، يتم تحميل لوحة في محلل فرس البحر وبدء الفحص.
- تحليل العينات. يتم تنفيذ بشكل روتيني تحليلين مختلفة.
- برنامج القاعدية التنفس التنفس / الحد الأقصى (تقريبا مدة 90 دقيقة). تغييرات في التنفس ضعف التمثيل الغذائي القاعدي دعم، في حين تنفس القصوى هي مقياس لإجمالي الطاقة الإنتاجية الطاقة والتغييرات في هذه المعلمة المرتبطة مع عدد من الدول على حد سواء المرضية والفسيولوجية. ويحسب أيضا قدرة الجهاز التنفسي الغيار، أو القدرة على نظام لزيادة إنتاج ATP،من هذا الاختبار من قبل الطرح من القاعدية من التنفس القصوى. يتم تنفيذ ثلاثة يكرر كل مزيج (2 دقيقة) / الانتظار (1 دقيقة) / قياس (2 دقيقة) دورة لتأسيس أول التنفس القاعدية. في نهاية الدورة الثالثة، تتم إضافة تركيز النهائي من 2.5 ميكرومتر من FCCP (الميتوكوندريا protonophore / uncoupler) إلى كل جانب السماح قياس التنفس الأقصى. ثم يتم تكرار دورة القياس 5 إلى 8 مرات (الشكل 3).
- ATP البرنامج تسرب دوران / بروتون (مدة حوالي 60 دقيقة). التنفس بسبب دوران ATP يمثل وظيفة رئيسية من الميتوكوندريا في شكل ATP الإنتاج، في حين يرتبط ارتباطا لا انفصام التنفس بسبب تسرب بروتون، أو التنفس فكت، مع غيرها من المعالم وظيفة الميتوكوندريا بما في ذلك التنفس والقاعدية على رد الفعل تشكيل أنواع الاكسجين. ويمثل التنفس بسبب دوران ATP عن طريق الفرق في التنفس بعد إضافة أوليغوميسين ميكرومتر 25 (مثبط لATP سينسيز) مقارنة التنفس القاعدية. فكت التنفس، أو التنفس بسبب تسرب بروتون، يتم تحديدها من قبل حساب الفرق بين أوليغوميسين بوساطة التنفس والتنفس بعد إضافة روتينون ميكرومتر 25 (المانع I المعقدة). وتتكرر دورات قياس 8 مرات بعد إضافة كل مثبط الميتوكوندريا.
- إعداد لوحة XF 24 جزيرة جيدا 24. يعمل التسلسل التالي التجريبية:
في نهاية أشواط، يعني القيم من السيطرة 10 و 10 الأجنة المعالجة كيميائيا وتحسب.
الجزء 3: النفط الأحمر-O تلوين
- وdechorionated الأجنة في 50 HPF باستخدام ملقط غرامة وإصلاحها في PFA 4٪ بين عشية وضحاها في C. ° 4
- يتم تنفيذ نفط الأحمر-O تلطيخ، كما هو موضح سابقا 2 (انظر الشكل 4).
Representative Results
ونحن مهتمون في فهم دور جينات معينة على عملية التمثيل الغذائي، وخصوصا معدل التنفس واستقلاب الشحوم. لذلك، نحن يعاملون البرية الأجنة الزرد نوع ابتداء من HPF 26 مع مثبط لانزيم محدد بالعقاقير المشفرة بواسطة واحد من هذه الجينات. في 50 HPF، تم تحليل نصف السيارة والأجنة المانع المعالجة باستخدام وظيفة الميتوكوندريا فرس البحر، في حين كانت ثابتة النصف المتبقي في PFA 4٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في وقت لاحق وملطخة لترسب الدهون مع النفط-O الأحمر. أدت المعاملة مع مثبط إنزيم معين ل~ 2 أضعاف في زيادة التنفس القاعدية (الشكل 4A)، والذي كان مرتبطا مع زيادة في ترسب الدهون خاصة في الدماغ الانتهائي وتحت الحويصلة الأذنية (الشكل 4B، C).
pload/4300/4300fig1highres.jpg "/>
الشكل 1. التمثيل التخطيطي للعلاج الكيميائي للأجنة الزرد. Wildtype والأجنة وراثيا الزرد التلاعب، أو المعالجة الدوائية هي الخلفية.
الشكل 2. XF24 جزيرة لوحة اقامة. (A) تحتوي على أربعة آبار المتوسطة الجنينية فقط التحكم في درجة الحرارة (تميزت X) وغيرها تحتوي على جنين واحد / أيضا. (B) عن قرب من بئر واحد (C6) تظهر بنسبة 50 HPF الجنين نوع البرية تعامل مع السيارة (DMSO) التي تغطيها شاشة التقاط جزيرة (رأس السهم).
الشكل 3. Respiratالمعلمات لايون البرية الأجنة الزرد بكتابة 50 HPF. (A) بالنسبة لكل قياس، يتم تقديم متوسط الأجنة 20 فرد. التنفس القاعدية (يعني: 299،7؛ SD: 75،7؛ SEM: 16.9)، والتنفس القصوى (يعني: 387،4؛ SD: 93.3؛ SEM: 20.9)، سعة الجهاز التنفسي الغيار (يعني: 87.7؛ SD: 72.0؛ SEM: 16.1). (B) بالنسبة لكل قياس، يتم تقديم متوسط عدد 20 نتيجة الفردية. الميتوكوندريا التنفس القاعدية؛ التنفس الميتوكوندريا بسبب دوران ATP؛ الميتوكوندريا التنفس والتنفس فكت غير الميتوكوندريا. MT: الميتوكوندريا؛ SRC: سعة الجهاز التنفسي الغيار؛ SD: الإنحراف المعياري، SEM: الخطأ المعياري للمتوسط. يتم عرض النتائج في بمول من استهلاك O 2 / دقيقة / الجنين. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 4. الدعوة موجهةsentative نتائج التعرض للمواد الكيميائية على التنفس وترسب الدهون القاعدية. (A، B) 50 HPF الجنين ملطخة النفط-O الأحمر في طريقة العرض الجانبي. حضنت الجنين مع مثبط انتقائي (B) يعرض أكثر تلطيخ النفط-O الأحمر في الدماغ الانتهائي (رأس السهم) وتحت الحويصلة الأذنية (السهم) مقارنة جنين السيطرة على السيارة المعاملة. (C) بصل التنفس يظهر ~ 2 أضعاف في زيادة الأجنة المعالجة كيميائيا (ن = 10 الأجنة لكل مجموعة). يتم عرض النتائج في بمول من O 2 / دقيقة / الجنين.
Discussion
الزرد هو نموذج راسخة الوراثية لكل من الأمام (ENU الطفرات) وعكس (الفلاحة، الزنك الاصبع نوكلياز المستهدفة طرق المغادرة، morpholino ضربة قاضية) النهج الوراثية 3،4، في حين يمكن أيضا وظيفة الجينات في الأجنة الزرد يكون قد تم حظره بسهولة أو تنشيط استخدام المركبات الدوائية انتقائية محددة للمنتجات المشفرة. نظرا لتنميتها الخارجية وصغر حجمها، والأجنة الزرد هي مناسبة خاصة للتحليل الأيض. ومع ذلك، وقياس قوية من الملف التمثيل الغذائي وظيفة الميتوكوندريا في الجسم الحي في الأجنة الزرد لم يتحقق، مع واحد فقط وصف الأولية أفادت 5. كان مصمما أصلا للدراسات تحليل فرس البحر الأيض خلية القاعدة وثبت لإعطاء نتائج دقيقة وموثوق بها 6. تطبيق هذه المنهجية الجديدة إلى الأجنة الزرد كبير، ومن المرجح أن تزيد من رقعة استخدام هذا النموذج للدراسات التمثيل الغذائي.
في هذه الدراسة، أن نبرهن قياس مجموعة من المعلمات في التنفس الأجنة الزرد باستخدام محلل فرس البحر، بما في ذلك التنفس القاعدية، والتنفس القصوى، والقدرة التنفسية الغيار، والدوران ATP وتسرب بروتون. كما نقوم بتوفير مثال على الكيفية التي يمكن بها ارتباطا هذه القياسات الفسيولوجية الأخرى مع المعلمات، في هذه الحالة تراكم الدهون، واستخدام مثبطات الدوائية في فحص هذا النظام. جنبا إلى جنب مع استخدام الأجنة وراثيا تغيير، وهذا يوفر منصة قوية لفهم العوامل التجريبية التي تؤثر على عملية التمثيل الغذائي.
وهناك مجموعة متنوعة من التطبيقات لهذه المنهجية الجديدة، مع ضعف الميتوكوندريا هو متورط في العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، مثل داء السكري 7، السمنة 8، التصلب المتعدد 9، أمراض باركنسون 10، مرض الزهايمر 11 و نوع من السرطانات 12. الأهم من ذلك، يايتم تنفيذ العمل اور في الجسم الحي، حيث كل التأثيرات البيئية - مثل السيتوكينات وغيرها ذات الصلة بالتنمية النمو - تنشط، وبالتالي توفير وجهة نظر ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الجسم الحي التنفس والتمثيل الغذائي الملف. كما يتم أيضا إجراء روتيني شاشات الكيميائية في النوع البري ومتحولة الأجنة الزرد الخلفية (الشكل 1)، والمستحضرات الصيدلانية الرواية التي يمكن التنفس تأثير، وظيفة الميتوكوندريا أو الأيض التعرف عليها بسهولة باستخدام محلل فرس البحر. ويمكن استخدام نتائج إنشاؤها باستخدام محلل فرس البحر جنبا إلى جنب مع غيرها من المقايسات لتقديم معلومات إضافية. وهذا يمكن أن تشمل تحليل الفسيولوجية، مثل النفط تلوين الأحمر، أو تحليل الجزيئي، كما هو الحال في الموقع التهجين لعلامات محددة مثل خلية شحمية cebpα، Pparα، Pparγ، FAS الخ.
لا تزال هناك بعض القيود على هذه المنهجية. على الرغم من أن كنا وغيرها قادرة على استخدام أوليغوميسين إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافلدى عودتهم ATP الإنتاج وتسرب بروتون على الأجنة الشباب 5 (انظر الشكل 3)، في الأجنة أقدم من 60 أوليغوميسين HPF العلاج غير فعال. نعتقد أن أقدم أجنة في أوليغوميسين لا يمكن نشر بسهولة من الأصغر سنا في الأجنة جعل من المستحيل تفسير النتائج. منذ أوليغوميسين النتائج إلزامية لتحديد التنفس بسبب دوران ATP التنفس وفكت، نقوم حاليا بالتحقيق في تركيزات أعلى من أوليغوميسين لكبار السن الأجنة. ومع ذلك، antimycin A العلاجات تبقى فعالة لفترة أطول، مع القياسات الأخرى، مثل التنفس القاعدية، التنفس والقدرة التنفسية القصوى الغيار، لا يمكن أن يؤديها في الأجنة الزرد أقدم، HPF يصل إلى 68 (لا تظهر).
ومن أوجه القصور في استخدام محلل فرس البحر الحالي هو الإعداد المساحة الفعلية داخل كل لوحة القبض على جزيرة جيدا، بحيث تكون مناسبة فقط للأجنة ويرقات اسماك الزرد الشباب. ولذلك، وأداء metabolجيم الدراسات بشأن النظام الغذائي الناجم عن السمنة في الأسماك البالغة، على سبيل المثال، ليس ممكنا من الناحية الفنية حتى الآن. ومع ذلك، قد يدفع هذه الدراسة تطوير لوحات صممت خصيصا لصغار الأسماك أو الكبار مما يؤدي إلى تمديد نطاق التحليلات ممكن.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر موظفي مرفق ديكين اسماك الزرد جامعة لتوفير الرعاية الممتازة تربية مستمرة. ويدعم من قبل YG زمالة ألفرد ديكين أبحاث ما بعد الدكتوراه ومنحة بحثية من جامعة ديكين الوسطى. ويدعم من قبل حركة تحرير السودان زمالة التطوير الوظيفي NHMRC. ويدعم ACW بمنحة تمكين NHMRC. ويدعم جميع الكتاب من قبل مركز البحوث البحوث الاستراتيجية الجزيئية والطبية في جامعة ديكين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).
- Ingham, P. W. The power of the zebrafish for disease analysis. Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development. Plos One. 6, e25652 (2011).
- McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics. Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).
- Sivitz, W. I., Yorek, M. A. Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities. Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).
- Bournat, J. C., Brown, C. W.
- Ghafourifar, P., et al.
- Winklhofer, K. F., Haass, C.
- Maruszak, A., Zekanowski, C. Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).
- de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer. Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).
