Summary
Zebrafisk repræsenterer en magtfuld hvirveldyr model, der har været underudnyttet for metaboliske studier. Her beskriver vi en hurtig måde at måle
Abstract
En voksende mål inden for stofskifte er at fastslå virkningen af genetik på forskellige aspekter af mitokondriefunktionen. Forståelsen af disse forbindelser vil hjælpe med at forstå den underliggende ætiologi for en række sygdomme, der er forbundet med mitokondriel dysfunktion, såsom diabetes og fedme. Nylige fremskridt inden for instrumentering, har muliggjort overvågning af forskellige parametre for mitokondriefunktion i cellelinier eller væv eksplantater. Her præsenterer vi en metode til en hurtig og følsom analyse af mitokondrielle funktionsparametre in vivo under zebrafisk embryonale udvikling ved hjælp af Seahorse biovidenskab XF 24 ekstracellulære flux analysator. Denne protokol udnytter Islet Capture mikroplader hvor en enkelt embryo er placeret i hver brønd, hvilket tillader måling af bioenergetik, herunder: (i) basal respiration, (ii) basal mitokondriel respiration (iii) mitokondriel respiration som følge af ATP omsætning (iv) mitochondrial ukoblet respiration eller prOton læk og (iv) højst åndedræt. Denne fremgangsmåde benyttes embryonale zebrafisk respiration parametre kan sammenlignes mellem vildtype og genetisk ændrede embryoner (mutant, gen overekspression eller gen knockdown) eller de manipulerede farmakologisk. Det forventes, at udbredelsen af denne protokol vil give forskerne med nye værktøjer til at analysere den genetiske basis af stofskiftesygdomme in vivo i dette relevante hvirveldyr model.
Protocol
Del 1: kemisk behandling af zebrafisk embryoner
- Saml zebrafisk embryoner efter befrugtningen. Inkuber ved 28,5 ° C i E3 medium i 100 x 15 mm petriskåle Note:. Til in situ-hybridisering eller Olie-rød-O-farvning, er 1-phenyl-2-thiourinstof (PTU) i en slutkoncentration på 0,2 mM tilsat til inhibere pigmentdannelse, 1, men er ikke nødvendig for Seahorse analyse.
- For farmakologiske undersøgelser, tilsættes den krævede kemiske ved en passende slutkoncentration på at udvikle zebrafisk embryoner på omkring 26 timer efter befrugtning (HPF) med et passende vehikel-only kontrol Note:. For lysfølsomme farmakologiske inhibitorer, kan embryoner får lov til at udvikle sig i Den mørke før analyse.
Del 2: Live Metabolic Profile Brug af Seahorse XF 24 Analyser
- Før hver kørsel, at Søhest XF 24 Analyser patron huser O 2 og H
- Fremstillinq af 24-brønds XF 24 ø-plade. Den følgende eksperimentelle sekvens anvendes:
- Da iltforbruget er følsom over for temperatursvingninger, er fire brønde anvendes til at kontrollere for eventuelle temperatursvingninger på tværs af pladen. Disse huller indeholder ikke embryoner, men er fyldt med 700 pi E3 medium (figur 2A).
- De resterende 20 brønde (se punkt 2.2) er fyldt med 700 pi E3 medium og ét æg hver (figur 2B).
- For hvert forsøg, er 10 embryoer behandlet med vehikel alene (kontrol) og 10 behandlet med kemisk inhibitor (behandlet). Kontrol og behandlede fostre vekslede (f.eks godt A2: kontrol embryo, godt A3: behandlet embryo: well A4: kontrol embryo, godt A5 behandlet embryo, etc).
- En ø optagelsesskærmen tilsættes på toppen af. hver brønd for at sikre, at prøven forbliver i målekammeret hele assayet (figur 2B) Note: kemisk-behandlede embryoer forbliver i deres oprindelige kemisk opløsning under hele proceduren, uden behov for at udvaske den kemiske forud kører Søhest analysatoren program.
- Når færdig, er pladen indlæst i Søhest Analyser og assayet startes.
- Analyse af prøver. To forskellige assays udføres rutinemæssigt.
- Basal respiration / Maximum respiration program (varighed ca. 90 min). Ændringer i basal respiration understøtte metabolisk dysfunktion, mens maksimal respiration er et mål for den samlede energiproduktion kapacitet og ændringer i denne parameter forbundet med et antal af både patologiske og fysiologiske tilstande. Den ekstra respiratorisk kapacitet eller kapacitet til systemet til yderligere at øge ATP-produktion, også beregnesfra denne test ved subtraktion af basal fra maksimal respiration. Tre gentagelser af hver mix (2 min) / wait (1 min) / måling (2 min) cyklus udføres først at etablere basal respiration. Ved afslutningen af den tredje cyklus, er en slutkoncentration på 2,5 uM FCCP (mitochondrial protonophore / afkobleren) til hver brønd tillader måling af maksimal respiration. Målingen cyklus gentages 5-8 gange (figur 3).
- ATP omsætning / Proton lækage program (varighed ca. 60 min). Respiration som følge af ATP omsætning udgør den vigtigste funktion af mitokondrier i form af ATP-produktion, mens respiration som følge af proton-lækage, eller afkoblede respiration, er uløseligt forbundet med andre parametre for mitokondriefunktion herunder basal respiration og reaktive oxygenformer dannes. Respiration som følge af ATP omsætning er repræsenteret ved forskellen i respiration efter tilsætning af 25 uM oligomycin (en hæmmer af ATP synthase) sammenlignet med basal respiration. Ukoblet respiration eller respiration som følge af proton lækage, bestemmes ved at beregne forskellen mellem oligomycin-medieret respiration og respiration efter tilsætning af 25 uM rotenon (et kompleks I-inhibitor). Målecyklusser gentages 8 gange efter tilsætning af hver mitochondrial inhibitor.
- Fremstillinq af 24-brønds XF 24 ø-plade. Den følgende eksperimentelle sekvens anvendes:
Ved afslutningen af forsøgene, middelværdier af 10 kontrol-og 10 kemisk behandlede embryoer beregnes.
Del 3: Olie-Red-O farvning
- Embryoer ved 50 HPF er dechorionated med fine tænger og fikseret i 4% PFA natten over ved 4 ° C.
- Olie-rød-O-farvning udføres som tidligere beskrevet 2 (se figur 4).
Representative Results
Vi er interesseret i at forstå den rolle specifikke gener på stofskiftet, især respirationsfrekvens og lipidmetabolisme. Vi derfor behandlede vildtype zebrafisk embryoner fra 26 HPF fremefter med en specifik farmakologisk inhibitor af enzymet, der kodes af et af disse gener. Ved 50 HPF blev halvdelen af køretøjet og inhibitor-behandlede embryoer analyseret under anvendelse af Søhest for mitokondriefunktion, mens den anden halvdel blev fikseret i 4% PFA natten over ved 4 ° C og derefter farvet for lipid deposition med olie-rød-O. Behandling med det specifikke enzym inhibitor medførte en ~ 2 gange stigning i basal respiration (figur 4A), hvilket var forbundet med en forøgelse af lipidaflejring især i telencephalon og under otisk vesikel (figur 4B, C).
pload/4300/4300fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Skematisk fremstilling af kemisk behandling af zebrafisk embryoner. Vildtype, genetisk manipulerede eller farmakologisk behandlet zebrafisk embryoner er baggrund.
Figur 2. XF24 ø plade sat op. (A) Fire brønde indeholder embryonale medium kun som temperaturkontrol (markeret med X), og de andre indeholder ét æg / brønd. (B) Close-up af en brønd (C6), der viser en 50 HPF vildtype embryo behandlet med vehikel (DMSO) er omfattet af en ø capture skærm (pilespids).
Figur 3. Respiration parametre for vildtype 50 HPF zebrafisk embryoner. (A) For hver måling er gennemsnittet af de 20 individuelle embryoner præsenteret. Basal respiration (Mean: 299,7, SD: 75,7; SEM: 16,9), Maksimal respiration (Mean: 387,4, SD: 93,3; SEM: 20,9), Spare Respiratory Capacity (Mean: 87,7; SD: 72,0; SEM: 16,1). (B) For hver måling, er gennemsnittet af de 20 individuelle resultater præsenteret. Basal mitochondrial respiration, mitochondrial respiration på grund af ATP omsætning, mitochondrial ukoblet respiration og ikke-mitokondrie åndedræt. Mt: mitochondrial, SRC: Spare Respiratory Kapacitet SD: Standardafvigelse, SEM: Standard Error over Mean. Resultaterne er præsenteret i pmol O 2 forbrugt / min / embryo. Klik her for at se større figur .
Figur 4. Reprærepræsentative resultater af kemisk eksponering på basal respiration og lipidaflejring. (A, B) 50 HPF embryo farvet med Oil-Red O i lateral view. Embryonet inkuberet med selektiv inhibitor (B) viser mere Olie-rød-O-farvning i telencephalon (pilespids) og ned under otisk vesikel (pil) sammenlignet med en vehikel-behandlede kontrolgruppe embryo. (C) Basal respiration viser et ~ 2 gange stigning i kemisk behandlede embryoer (n = 10 embryoner pr gruppe). Resultaterne er præsenteret i pmol O 2 / min / embryo.
Discussion
Zebrafisk er en veletableret genetisk model både fremad (ENU mutagenese) og reverse (Tilling, zinkfinger nuclease målrettet knock-out, morpholino knockdown) genetiske fremgangsmåder 3,4, mens genfunktion i zebrafisk embryoner også let kan blokeres eller aktiveret anvendelse af selektive farmakologiske forbindelser specifikke for de kodede produkter. På grund af deres eksterne udvikling og lille størrelse, zebrafisk embryoner er særligt egnede til metabolisk analyse. Imidlertid er robust måling af metaboliske profil og mitokondriefunktion in vivo i zebrafisk embryoner ikke opnået, med kun en foreløbig beskrivelse rapporteres 5. Seahorse analyse blev oprindeligt designet til cellebaserede metaboliske undersøgelser, og har vist sig at give nøjagtige og pålidelige resultater 6. Anvendelsen af denne nye metode til zebrafisk embryoner er betydelig, og sandsynligvis vil øge den bredere anvendelse af denne model for metaboliske studier.
I denne undersøgelse viser vi måling af en række åndedræt parametre i zebrafisk embryoner ved hjælp af Seahorse Analyser, herunder basal respiration, maksimal respiration, ekstra respiratorisk kapacitet, ATP omsætning og proton lækage. Vi også tilvejebringe et eksempel på hvordan sådanne målinger kan korreleres med andre fysiologiske parametre, i dette tilfælde lipidakkumulering, og for anvendelse af farmakologiske inhibitorer i dette assaysystem. Kombineret med brugen af genetisk ændrede embryoner, giver dette et stærkt eksperimenterende platform for forståelse af faktorer, der påvirker stofskiftet.
Der findes en række anvendelser for denne nye metodik, med mitokondriel dysfunktion er impliceret i mange humane sygdomme, såsom diabetes mellitus 7, fedme 8, multipel sklerose 9, Parkinsons sygdomme 10, Alzheimers sygdom 11 og nogle typer cancere 12. Vigtigere, our arbejde udføres in vivo, hvor alle miljømæssige påvirkninger - såsom cytokiner, udvikling-relateret vækst osv - er aktive, hvilket giver en fysiologisk relevant visning in vivo åndedræt og metabolisk profil. Som kemiske skærme også udføres rutinemæssigt i vildtype og mutant baggrund zebrafisk embryoner (figur 1), hidtil ukendte farmaceutiske der påvirker respiration, mitokondrier funktion eller metabolisme kan let identificeres ved hjælp af Søhest analysatoren. De resultater, der genereres ved hjælp af Søhest analysatoren kan anvendes i forbindelse med andre assays til at give yderligere information. Dette kan omfatte fysiologisk analyse, såsom olie-rød farvning eller molekylær analyse, såsom in situ-hybridisering for specifikke adipocyt-markører, såsom cebpα, PPARa, PPARy, FAS osv.
Der er stadig visse begrænsninger i denne metode. Selv om vi og andre kunne bruge oligomycin har væUre ATP produktion og proton læk på unge embryoner 5 (se figur 3), i embryoner ældre end 60 HPF oligomycin behandling er ineffektiv. Vi mener, at i ældre fostre oligomycin kan ikke diffundere så let end hos yngre embryoner gøre resultaterne umuligt at fortolke. Da oligomycin resultaterne er obligatoriske for bestemmelse af respiration på grund af ATP omsætning og afkoblet respiration, er vi gang med at undersøge højere koncentrationer af oligomycin for ældre embryoner. Imidlertid antimycin behandlinger forbliver effektive længere, med andre målinger, såsom basal respiration, maksimal respiration og ekstra respiratorisk kapacitet, kan udføres i ældre zebrafisk embryoner, op til 68 HPF (ikke vist).
En anden begrænsning i at bruge den aktuelle Seahorse Analyser setup er det fysiske rum inden for hver ø capture plade godt, således at de kun er velegnede til zebrafisk embryoner og unge larver. Derfor udfører Metabolic undersøgelser af kost-induceret fedme hos voksne fisk, for eksempel, er endnu ikke teknisk muligt. Imidlertid kan denne undersøgelse driver udviklingen af plader er specielt designet til ung eller voksen fisk, hvorved udvidelse af analyser mulige.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke de ansatte i Deakin University zebrafisk Facility for at levere fremragende løbende dyrehold pleje. YG er understøttet af en Alfred Deakin Postdoc Research Fellowship og et Central Research Grant fra Deakin University. SLM er understøttet af en NHMRC Career Development Fellowship. ACW er understøttet af en NHMRC Aktivering Grant. Alle forfattere er støttet af Molecular & Medical Research Strategisk Forskningscenter ved Deakin University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).
- Ingham, P. W. The power of the zebrafish for disease analysis. Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development. Plos One. 6, e25652 (2011).
- McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics. Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).
- Sivitz, W. I., Yorek, M. A. Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities. Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).
- Bournat, J. C., Brown, C. W. Mitochondrial dysfunction in obesity. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).
- Ghafourifar, P., et al. Mitochondria in multiple sclerosis. Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Maruszak, A., Zekanowski, C. Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).
- de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer. Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).
