Sebrafisk representerer en kraftig virveldyr modell som har vært lite benyttet for metabolske studier. Her beskriver vi en rask måte å måle<em> In vivo</em> Metabolsk profil utvikle sebrafisk som tillater sammenligning av ulike mitokondrie funksjonsparametere mellom genetisk eller farmakologisk manipulerte embryoer, og dermed øke anvendbarheten av denne organisme.
En økende mål innen stoffskiftet er å fastslå effekten av genetikk på ulike aspekter av mitokondrienes funksjon. Forstå disse sammenhengene vil bidra til å forstå den underliggende etiologi for en rekke sykdommer forbundet med mitokondriell dysfunksjon, slik som diabetes og fedme. Nylige fremskritt innen instrumentering, har aktivert overvåkingen av distinkte parametere mitokondriefunksjon i cellelinjer eller vev eksplanter. Her presenterer vi en metode for en rask og følsom analyse av mitokondrie funksjonsparameterne in vivo under sebrafisk embryoutvikling med Seahorse biovitenskap XF 24 ekstracellulære flux analysator. Denne protokollen utnytter Islet Capture mikroplater hvor en enkelt embryo blir plassert i hver brønn, slik at måling av bioenergi, inkludert: (i) basal respirasjon, (ii) basal mitokondrie respirasjon (iii) mitokondrie åndedrett grunnet ATP omsetning, (iv) mitokondriell frikoblet åndedrett eller prOton lekkasje og (iv) maksimum åndedrett. Ved hjelp av denne tilnærmingen embryonale sebrafisk respirasjon parametere kan sammenlignes mellom vill type og genetisk endret embryoer (mutant, genet over-uttrykk eller gene knockdown) eller de manipulert farmakologisk. Det er forventet at formidling av denne protokollen vil gi forskere med nye verktøy for å analysere det genetiske grunnlaget for metabolske forstyrrelser in vivo i dette relevante virveldyr dyremodell.
Sebrafisk er et veletablert genetisk modell for både forover (ENU mutagenese) og revers (Tilling, sink finger nuklease målrettet knock-out, morfolino knockdown) genetiske tilnærminger 3,4, mens gen-funksjon hos sebrafisk embryo kan også lett blokkert eller aktivert hjelp selektive farmakologiske forbindelser som er spesifikke for de kodede produkter. På grunn av deres ytre utvikling og liten størrelse, sebrafisk embryoer er særlig egnet for metabolsk analyse. Imidlertid har robust måling av metabolsk profil og mitokondriell funksjon in vivo i sebrafisk embryoer ikke blitt oppnådd, med bare én foreløpige beskrivelse rapporterte 5. Sjøhest analyse ble opprinnelig utviklet for celle-baserte metabolske studier og har vist seg å gi nøyaktige og pålitelige resultater 6. Anvendelsen av denne nye metodikken til sebrafisk embryo er betydelig, og sannsynligvis forsterke bredere bruk av denne modellen for metabolske studier.
I denne studien, viser vi måling av en rekke respirasjon parametere i sebrafisk embryo ved hjelp av Seahorse Analyser, inkludert basal respirasjon, maksimal respirasjon, reservedeler luftveiene kapasitet, ATP omsetning og proton lekkasje. Vi har også et eksempel på hvordan slike målinger kan være korrelert med andre fysiologiske parametere, i dette tilfellet fettakkumulering, og ved bruk av farmakologiske inhibitorer i denne assaysystem. Kombinert med bruk av genetisk endrede embryoer, gir dette en kraftig eksperimentell plattform for å forstå faktorer som påvirker på stoffskiftet.
Det finnes en rekke anvendelser for denne nye metode, med mitokondriell dysfunksjon er innblandet i mange menneskelige sykdommer, slik som diabetes 7 mellitus, fedme 8, multippel sklerose 9, Parkinsons sykdommer 10, Alzheimers sykdom 11 og noen type kreft 12. Viktigere, our arbeidet utføres in vivo, der alle miljømessige påvirkninger – for eksempel cytokiner, utviklingsrelatert vekst osv – er aktive, og dermed gi en fysiologisk relevant visning in vivo åndedrett og metabolsk profil. Som kjemiske skjermer er også rutinemessig utført i villtype og mutant bakgrunn sebrafisk embryo (figur 1), roman legemidler som påvirker respirasjon, mitokondrier funksjon eller metabolisme kan lett identifiseres ved hjelp av Seahorse analysator. Resultatene som genereres ved hjelp av Seahorse analysator kan brukes i forbindelse med andre analyser for å gi ytterligere informasjon. Dette kan omfatte fysiologisk analyse, for eksempel olje-Red Staining eller molekylær analyse, for eksempel in situ hybridisering for spesifikke adipocyte markører som cebpα, Pparα, Pparγ, FAS etc.
Det gjenstår noen begrensninger i denne metodikken. Selv om vi og andre var i stand til å bruke oligomycin til tiltakure ATP produksjon og proton lekkasje på unge embryoer 5 (se figur 3), i embryoer eldre enn 60 HPF oligomycin behandling er ineffektiv. Vi tror at i eldre embryoer oligomycin ikke kan spres så lett enn hos yngre embryoer gjør resultatene umulig å tolke. Siden oligomycin resultatene er obligatorisk for bestemmelse av åndedrett grunn ATP omsetning og ukoblet åndedrett, er vi nå undersøker høyere konsentrasjoner av oligomycin for eldre embryoer. Imidlertid antimycin behandlinger forblir effektive lenger, med andre målinger, slik som basal respirasjon, maksimal respirasjon og reservedeler respiratorisk kapasitet, kan utføres i eldre sebrafisk embryoer, opptil 68 HPF (ikke vist).
En annen begrensning i bruk av nåværende Seahorse Analyser oppsett er den fysiske plassen innenfor hver holme fangst plate også, slik at de er kun egnet for sebrafisk embryo og unge larver. Derfor utfører metabolic studier på diett-indusert fedme i voksen fisk, for eksempel, er ikke ennå teknisk gjennomførbart. Imidlertid kan denne studien be utviklingen av platene spesielt utformet for juvenile eller voksen fisk, derved å utvide omfanget av analyser mulige.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke de ansatte medlemmer av Deakin University Sebrafisk Facility for å gi utmerket pågående dyrehold omsorg. YG er støttet av en Alfred Deakin Postdoktor Research Fellowship og Central Research Grant fra Deakin University. SLM er støttet av en NHMRC Career Development Fellowship. ACW er støttet av en NHMRC Aktivere Grant. Alle forfatterne støttes av molekylær og medisinsk forskning Strategic Research Centre ved Deakin University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
FCCP | Sigma | C2920 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 |