Zebrafisk repræsenterer en magtfuld hvirveldyr model, der har været underudnyttet for metaboliske studier. Her beskriver vi en hurtig måde at måle<em> In vivo</em> Metaboliske profil udvikle zebrafisk, der tillader sammenligning af forskellige mitokondriefunktion parametre mellem genetisk eller farmakologisk manipulerede embryoer og derved øge anvendeligheden af denne organisme.
En voksende mål inden for stofskifte er at fastslå virkningen af genetik på forskellige aspekter af mitokondriefunktionen. Forståelsen af disse forbindelser vil hjælpe med at forstå den underliggende ætiologi for en række sygdomme, der er forbundet med mitokondriel dysfunktion, såsom diabetes og fedme. Nylige fremskridt inden for instrumentering, har muliggjort overvågning af forskellige parametre for mitokondriefunktion i cellelinier eller væv eksplantater. Her præsenterer vi en metode til en hurtig og følsom analyse af mitokondrielle funktionsparametre in vivo under zebrafisk embryonale udvikling ved hjælp af Seahorse biovidenskab XF 24 ekstracellulære flux analysator. Denne protokol udnytter Islet Capture mikroplader hvor en enkelt embryo er placeret i hver brønd, hvilket tillader måling af bioenergetik, herunder: (i) basal respiration, (ii) basal mitokondriel respiration (iii) mitokondriel respiration som følge af ATP omsætning (iv) mitochondrial ukoblet respiration eller prOton læk og (iv) højst åndedræt. Denne fremgangsmåde benyttes embryonale zebrafisk respiration parametre kan sammenlignes mellem vildtype og genetisk ændrede embryoner (mutant, gen overekspression eller gen knockdown) eller de manipulerede farmakologisk. Det forventes, at udbredelsen af denne protokol vil give forskerne med nye værktøjer til at analysere den genetiske basis af stofskiftesygdomme in vivo i dette relevante hvirveldyr model.
Zebrafisk er en veletableret genetisk model både fremad (ENU mutagenese) og reverse (Tilling, zinkfinger nuclease målrettet knock-out, morpholino knockdown) genetiske fremgangsmåder 3,4, mens genfunktion i zebrafisk embryoner også let kan blokeres eller aktiveret anvendelse af selektive farmakologiske forbindelser specifikke for de kodede produkter. På grund af deres eksterne udvikling og lille størrelse, zebrafisk embryoner er særligt egnede til metabolisk analyse. Imidlertid er robust måling af metaboliske profil og mitokondriefunktion in vivo i zebrafisk embryoner ikke opnået, med kun en foreløbig beskrivelse rapporteres 5. Seahorse analyse blev oprindeligt designet til cellebaserede metaboliske undersøgelser, og har vist sig at give nøjagtige og pålidelige resultater 6. Anvendelsen af denne nye metode til zebrafisk embryoner er betydelig, og sandsynligvis vil øge den bredere anvendelse af denne model for metaboliske studier.
I denne undersøgelse viser vi måling af en række åndedræt parametre i zebrafisk embryoner ved hjælp af Seahorse Analyser, herunder basal respiration, maksimal respiration, ekstra respiratorisk kapacitet, ATP omsætning og proton lækage. Vi også tilvejebringe et eksempel på hvordan sådanne målinger kan korreleres med andre fysiologiske parametre, i dette tilfælde lipidakkumulering, og for anvendelse af farmakologiske inhibitorer i dette assaysystem. Kombineret med brugen af genetisk ændrede embryoner, giver dette et stærkt eksperimenterende platform for forståelse af faktorer, der påvirker stofskiftet.
Der findes en række anvendelser for denne nye metodik, med mitokondriel dysfunktion er impliceret i mange humane sygdomme, såsom diabetes mellitus 7, fedme 8, multipel sklerose 9, Parkinsons sygdomme 10, Alzheimers sygdom 11 og nogle typer cancere 12. Vigtigere, our arbejde udføres in vivo, hvor alle miljømæssige påvirkninger – såsom cytokiner, udvikling-relateret vækst osv – er aktive, hvilket giver en fysiologisk relevant visning in vivo åndedræt og metabolisk profil. Som kemiske skærme også udføres rutinemæssigt i vildtype og mutant baggrund zebrafisk embryoner (figur 1), hidtil ukendte farmaceutiske der påvirker respiration, mitokondrier funktion eller metabolisme kan let identificeres ved hjælp af Søhest analysatoren. De resultater, der genereres ved hjælp af Søhest analysatoren kan anvendes i forbindelse med andre assays til at give yderligere information. Dette kan omfatte fysiologisk analyse, såsom olie-rød farvning eller molekylær analyse, såsom in situ-hybridisering for specifikke adipocyt-markører, såsom cebpα, PPARa, PPARy, FAS osv.
Der er stadig visse begrænsninger i denne metode. Selv om vi og andre kunne bruge oligomycin har væUre ATP produktion og proton læk på unge embryoner 5 (se figur 3), i embryoner ældre end 60 HPF oligomycin behandling er ineffektiv. Vi mener, at i ældre fostre oligomycin kan ikke diffundere så let end hos yngre embryoner gøre resultaterne umuligt at fortolke. Da oligomycin resultaterne er obligatoriske for bestemmelse af respiration på grund af ATP omsætning og afkoblet respiration, er vi gang med at undersøge højere koncentrationer af oligomycin for ældre embryoner. Imidlertid antimycin behandlinger forbliver effektive længere, med andre målinger, såsom basal respiration, maksimal respiration og ekstra respiratorisk kapacitet, kan udføres i ældre zebrafisk embryoner, op til 68 HPF (ikke vist).
En anden begrænsning i at bruge den aktuelle Seahorse Analyser setup er det fysiske rum inden for hver ø capture plade godt, således at de kun er velegnede til zebrafisk embryoner og unge larver. Derfor udfører Metabolic undersøgelser af kost-induceret fedme hos voksne fisk, for eksempel, er endnu ikke teknisk muligt. Imidlertid kan denne undersøgelse driver udviklingen af plader er specielt designet til ung eller voksen fisk, hvorved udvidelse af analyser mulige.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke de ansatte i Deakin University zebrafisk Facility for at levere fremragende løbende dyrehold pleje. YG er understøttet af en Alfred Deakin Postdoc Research Fellowship og et Central Research Grant fra Deakin University. SLM er understøttet af en NHMRC Career Development Fellowship. ACW er understøttet af en NHMRC Aktivering Grant. Alle forfattere er støttet af Molecular & Medical Research Strategisk Forskningscenter ved Deakin University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
FCCP | Sigma | C2920 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 |