Zebrafish कि चयापचय के अध्ययन के लिए कम उपयोग किया गया है एक शक्तिशाली हड्डीवाला मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं. यहाँ हम एक तेजी से रास्ता नाप का वर्णन<em> Vivo में</em> विकासशील zebrafish कि आनुवंशिक या pharmacologically चालाकी से भ्रूण के बीच अलग mitochondrial समारोह मानकों की तुलना की अनुमति देता है, जिससे इस जीव के लागू करने में वृद्धि की चयापचय प्रोफ़ाइल.
चयापचय के क्षेत्र में एक से बढ़ लक्ष्य mitochondrial समारोह के विभिन्न पहलुओं पर आनुवंशिकी के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए है. इन रिश्तों को समझना mitochondrial रोग, मधुमेह और मोटापे के रूप में के साथ जुड़े रोगों की एक श्रृंखला के लिए अंतर्निहित एटियलजि को समझने में मदद मिलेगी. इंस्ट्रूमेंटेशन के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों, सेल लाइनों या ऊतक explants में mitochondrial समारोह के विशिष्ट मानकों की निगरानी के लिए सक्षम है. यहाँ हम vivo में mitochondrial समारोह मानकों के zebrafish भ्रूण के विकास के दौरान तेजी से और संवेदनशील Seahorse bioscience XF 24 कोशिकी प्रवाह विश्लेषक का उपयोग विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल आइलेट कब्जा जहां एक ही भ्रूण प्रत्येक कुएं में रखा गया है microplates, bioenergetics की माप की अनुमति है, जिनमें शामिल हैं: (i) बेसल श्वसन, (ii) बेसल mitochondrial श्वसन (iii) mitochondrial एटीपी कारोबार के लिए कारण श्वसन, mitochondrial (iv) uncoupled श्वसन या जनसंपर्कOton रिसाव और (iv) अधिकतम श्वसन. इस दृष्टिकोण भ्रूण zebrafish श्वसन मापदंडों का उपयोग जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से परिवर्तित (उत्परिवर्ती, जीन से अधिक अभिव्यक्ति या जीन पछाड़ना) भ्रूण या pharmacologically चालाकी से लोगों के बीच तुलना की जा सकती है. यह अनुमान है कि इस प्रोटोकॉल के प्रसार के नए उपकरणों के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करने के लिए यह प्रासंगिक हड्डीवाला पशु मॉडल में vivo में चयापचय विकारों के आनुवंशिक आधार का विश्लेषण करेगा.
Zebrafish दोनों (ENU mutagenesis) आगे और रिवर्स (तिलिन्ग, जस्ता उंगली nuclease लक्षित दस्तक बाहर, morpholino पछाड़ना) आनुवंशिक दृष्टिकोण 3,4 के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित आनुवंशिक मॉडल है, जबकि zebrafish भ्रूण में जीन समारोह भी आसानी से अवरुद्ध किया जा सकता है या सक्रिय चयनात्मक औषधीय इनकोडिंग उत्पादों के लिए विशिष्ट यौगिकों का उपयोग. उनके बाहरी विकास और छोटे आकार के कारण, zebrafish भ्रूण चयापचय विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं. हालांकि, चयापचय प्रोफ़ाइल और zebrafish भ्रूण में vivo में mitochondrial समारोह के मजबूत माप, केवल एक प्रारंभिक विवरण के साथ नहीं हासिल किया गया है 5 की सूचना दी. Seahorse विश्लेषण मूल कोशिका आधारित चयापचय के अध्ययन के लिए डिजाइन किया गया है और सही और विश्वसनीय परिणाम 6 देने के लिए प्रदर्शन किया गया. इस नई पद्धति के zebrafish भ्रूण के लिए आवेदन महत्वपूर्ण है, और चयापचय अध्ययन के लिए इस मॉडल का व्यापक उपयोग में वृद्धि की संभावना है.
इस अध्ययन में, हम zebrafish Seahorse बेसल श्वसन, अधिक से अधिक श्वसन, स्पेयर सांस की क्षमता, एटीपी कारोबार और प्रोटॉन रिसाव सहित विश्लेषक, का उपयोग भ्रूण में श्वसन मानकों की एक श्रृंखला के माप को प्रदर्शित करता है. हम भी कैसे इस तरह के मापन इस मामले लिपिड संचय में, और इस परख प्रणाली में औषधीय inhibitors का उपयोग अन्य शारीरिक मापदंड, साथ सहसंबद्ध किया जा सकता का एक उदाहरण प्रदान करते हैं. आनुवंशिक रूप से परिवर्तित भ्रूण के उपयोग के साथ संयुक्त, यह चयापचय को प्रभावित करने वाले कारकों को समझने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक मंच प्रदान करता है.
इस नई पद्धति के लिए आवेदन के साथ एक mitochondrial रोग डायबिटीज मेलिटस 7, 8 मोटापा, एकाधिक काठिन्य 9, पार्किंसंस रोग 10, अल्जाइमर रोग 11 और 12 के कैंसर के कुछ प्रकार के रूप में कई मानव रोगों में फंसा है, विभिन्न प्रकार के होते हैं. महत्वपूर्ण बात ओ,साइटोकिन्स, विकास से संबंधित विकास आदि जैसे – उर काम vivo, जहां सभी पर्यावरणीय प्रभावों में किया जाता है सक्रिय हैं, जिससे vivo श्वसन और चयापचय प्रोफ़ाइल में एक physiologically प्रासंगिक दृश्य प्रदान. रासायनिक स्क्रीन के रूप में भी नियमित जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि (1 चित्रा) zebrafish भ्रूण, उपन्यास दवाइयों कि प्रभाव श्वसन mitochondria समारोह या चयापचय आसानी Seahorse विश्लेषक का उपयोग पहचान सकता है में प्रदर्शन कर रहे हैं. Seahorse विश्लेषक का उपयोग उत्पन्न परिणाम अन्य assays के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और अतिरिक्त जानकारी प्रदान करने के लिए. यह तेल लाल धुंधला के रूप में शारीरिक विश्लेषण, या आणविक विश्लेषण, ऐसे cebpα, Pparα के रूप में विशिष्ट adipocyte मार्करों के लिए स्वस्थानी संकरण में के रूप में, Pparγ, आदि FAS शामिल कर सकते हैं
इस पद्धति के लिए कुछ सीमाएं रहते हैं. हालांकि हम दूसरों meas के लिए oligomycin का उपयोग करने में सक्षम थेure एटीपी उत्पादन और युवा 5 (चित्र देखें 3) 60 HPF oligomycin उपचार से अधिक पुराने भ्रूण, भ्रूण पर प्रोटॉन रिसाव अक्षम है. हम मानते हैं कि पुराने भ्रूण में oligomycin के रूप में आसानी से नहीं की तुलना में युवा परिणाम व्याख्या करने के लिए असंभव बना भ्रूण में विसरित कर सकते हैं. चूंकि oligomycin परिणाम एटीपी कारोबार और uncoupled श्वसन के कारण श्वसन के निर्धारण के लिए अनिवार्य कर रहे हैं, हम वर्तमान में उम्र भ्रूण के लिए उच्च oligomycin की सांद्रता की जांच कर रहे हैं. हालांकि, antimycin उपचार प्रभावी बेसल श्वसन, अधिकतम श्वसन और स्पेयर सांस की क्षमता, पुराने zebrafish भ्रूण में किया जा सकता है, 68 HPF (नहीं दिखाया गया है) के रूप में अन्य माप, के साथ लंबे समय तक रहते हैं.
वर्तमान Seahorse विश्लेषक सेटअप का उपयोग करने में एक और सीमा प्रत्येक आइलेट पर कब्जा प्लेट के भीतर अच्छी तरह से शारीरिक अंतरिक्ष, ऐसी है कि वे केवल zebrafish भ्रूण और युवा लार्वा के लिए उपयुक्त हैं. इसलिए, metabol प्रदर्शनवयस्क मछली आहार प्रेरित मोटापे आईसी अध्ययन, उदाहरण के लिए, अभी तक तकनीकी रूप से संभव नहीं है. हालांकि, इस अध्ययन में विशेष रूप से किशोर या वयस्क मछली के लिए तैयार प्लेटों के विकास का संकेत है, जिससे संभावित विश्लेषण के दायरे का विस्तार हो सकता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों के लिए उत्कृष्ट चल रही पालन देखभाल प्रदान करने के लिए डीकिन विश्वविद्यालय Zebrafish सुविधा के स्टाफ के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. YG एक अल्फ्रेड डीकिन Postdoctoral रिसर्च फैलोशिप और डीकिन विश्वविद्यालय से एक केन्द्रीय अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित है. SLM एक NHMRC कैरियर विकास फैलोशिप द्वारा समर्थित है. ACW एक NHMRC सक्षम करने से अनुदान द्वारा समर्थित है. सभी लेखकों डीकिन विश्वविद्यालय में आण्विक व चिकित्सा अनुसंधान सामरिक अनुसंधान केंद्र द्वारा समर्थित हैं.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
E3 (embryonic medium) | Self made | – | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
FCCP | Sigma | C2920 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 |