Summary
ゼブラフィッシュは、代謝の研究のために十分に利用されている強力な脊椎動物のモデルを表しています。ここでは、測定するための迅速な方法を記述
Abstract
代謝の分野で成長している目標は、ミトコンドリア機能のさまざまな側面に遺伝の影響を判断することです。これらの関係を理解することは、糖尿病や肥満などのミトコンドリア機能不全と連動疾患の範囲のための基礎にある病因を理解するのに役立ちます。計装における最近の進歩は、細胞株や組織外植片のミトコンドリア機能の異なるパラメータの監視を可能にしました。ここでは、シーホースXFバイオサイエンス24細胞外フラックスアナライザーを用いてゼブラフィッシュ胚の発生過程で生体内でのミトコンドリア機能パラメータの迅速かつ高感度な分析のための方法を提示する。このプロトコルは、膵島キャプチャは単一胚を各ウェルに配置されている場合には、生体エネルギーの測定を可能にする、マイクロプレートを含む利用：基礎呼吸（i）を、ATPの代謝回転に起因する（ii）の基底ミトコンドリア呼吸（iii）のミトコンドリアの呼吸をし、（iv）ミトコンドリア切り離さ呼吸やPRoton漏れ及び（iv）の最大呼吸。このアプローチ胚ゼブラフィッシュの呼吸パラメータを使用すると、野生型および遺伝的に改変された胚（変異、遺伝子の過剰発現や遺伝子ノックダウン）またはその薬理学的に操作され、それらの間で比較することができます。それは、このプロトコルの普及はこの関連脊椎動物動物モデルにおける in vivoでの代謝性疾患の遺伝的基礎を分析するための新しいツールを研究者に提供することが予想されます。
Protocol
パート1：ゼブラフィッシュ胚の化学処理
- 受精後のゼブラフィッシュ胚を収集します。 28.5℃にて100でE3培地のC×15mmのペトリ皿を注：in situハイブリダイゼーションまたはオイルレッドO染色では、0.2mMの最終濃度で1 -フェニル-2 -チオ尿素（PTU）は、に追加されます、色素形成を阻害しますが、1タツノオトシゴ分析には必要ありません。
- 薬理学的研究については、適切な車両専用コントロールと約26時間後に受精（HPF）でゼブラフィッシュ胚を開発するための適切な最終濃度で必要な化学物質を追加注：光感受性薬理学的阻害のために、胚はで発展させることができる分析前に暗い。
パート2：シーホースXF 24アナライザーを使用したライブ代謝プロファイル
- O 2とHを収容する各実行の前に、シーホースXF 24アナライザーカートリッジ
- 24ウェルXFの24膵島プレートの作製。以下の実験シーケンスを採用している：
- 酸素消費量は温度の変動に敏感であるため、4つのウェルをプレート間で想定される温度変動を制御するために使用されます。これらの井戸は、胚が含まれていませんが、E3の培地を700μl（ 図2A）が充填されます。
- 残りの20ウェルは（パート2.2を参照）、E3培地と1つの胚それぞれ（ 図2B）を700μlに満ちている。
- 各実験では、10胚は車両のみ（コントロール）と10化学阻害剤（処理）で処理で処理される。対照および処理胚は（：;：処理胚：よくA4：制御胚、よくA5扱わ胚などよくA3コントロール胚ウェルA2 など ）を交互にされています。
- 膵島キャプチャ画面はの上に追加され。試料がアッセイ全体の測定室（ 図2B）のままであることを保証するために、各ウェル注：化学的処理された胚は前タツノオトシゴアナライザを実行している化学物質を洗い流す必要がなく、プロシージャ全体を通して、元の化学溶液に残るプログラム。
- 完了したら、プレートはタツノオトシゴアナライザーにロードされ、検定が開始されます。
- サンプルの分析。二つの異なるアッセイは日常的に行われている。
- 基礎呼吸/最大呼吸プログラム（期間：約90分）。基底呼吸の変化は、最大呼吸が病理学的および生理学的状態の両方の番号に関連付けられ、このパラメータの総エネルギー生産能力と変化の尺度である一方で、代謝機能不全を支える。予備の呼吸能力、またはさらなるATP産生を増加させるためのシステムの能力は、また計算されます最大呼吸から基底の減算によって、このテストによる。三各ミックスの反復（2分）/待機（1分）/測定（2分）のサイクルは、まず基底呼吸を確立するために行われる。第3サイクルの終わりに、FCCPの2.5μMの（ミトコンドリアprotonophore /脱共役剤）の最終濃度は、各ウェルの最大呼吸の測定を可能に追加されます。測定サイクルは、その後、5〜8倍（ 図3）を繰り返す。
- ATPのターンオーバー/プロトンリークプログラム（持続時間約60分）。 ATPの代謝回転に起因する呼吸がATP生産の形でミトコンドリアの主要な機能を表し、プロトンリーク、または非結合呼吸による呼吸しながら、密接に基礎呼吸と活性酸素種の形成を含むミトコンドリア機能の他のパラメータと連動しています。 ATPの代謝回転に起因する呼吸は、25μMオリゴ（の阻害剤を添加した後の呼吸量の差で表されるTPシンターゼ）基底呼吸に比べて。脱共役呼吸、またはプロトンリークによる呼吸は、25μMのロテノン（複合体Iの阻害剤）を添加した後のオリゴマイシン媒介呼吸と呼吸の間の差を計算することによって決定される。測定サイクルは、それぞれのミトコンドリア阻害剤を添加した後、8回繰り返される。
- 24ウェルXFの24膵島プレートの作製。以下の実験シーケンスを採用している：
実行の終了時に、10個のコントロールと10化学処理された胚の平均値を算出しています。
パート3：オイルレッドO染色
- 50 HPFの胚を4℃で一晩4％PFAで細かい鉗子を用いdechorionatedと固定されています
- オイルレッドO染色は、以前（ 図4を参照）2に記載されているように 、実行されます。
Representative Results
我々は、特に代謝、呼吸速度および脂質代謝に役割の特定の遺伝子を理解することに興味を持っています。したがって、我々はこれらの遺伝子の1つによってコードされる酵素の特異的な薬理学的阻害剤を用いたHPF 26年から野生型ゼブラフィッシュ胚を処理した。残りの半分を4％で固定している間50 HPFで、車両及び阻害剤で処理した胚の半分は、ミトコンドリア機能のためのタツノオトシゴを用いて分析したPFAの一晩4℃で、その後、オイルレッドOで脂質沈着のために染色。特定の酵素阻害剤による治療は特に終脳と耳胞（ 図4B、C）の下に脂質沈着の増加と関連していた基底呼吸で約2倍に増加し（ 図4A）、つながった。
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図1。ゼブラフィッシュ胚の化学的処理の概略図。野生型、遺伝的に操作され、またはその薬理学的に処理されたゼブラフィッシュ胚は背景です。
図2。 XF24膵島プレートが設定します。（）4つのウェルは、温度コントロールとしてのみ胚性媒体を含む（Xでマークされている）と他の人がよく1つの胚を含む/。 （B）は膵島キャプチャー画面（矢じり）で覆わ車両スルホキシド（DMSO）で処理された50 HPF野生型胚を示すだけでなく1（C6）のクローズアップ。
図3。 Respirat野生型50 HPFのゼブラフィッシュ胚のイオンパラメータは、（A）各測定では、20個の胚の平均が表示されます。基底呼吸（平均：299.7、SD：75.7; SEM：16.9）、最大呼吸（平均：387.4、SD：93.3; SEM：20.9）、スペア呼吸容量（平均：87.7、SD：72.0; SEM：16.1）。 （B）の各測定では、20個々の結果の平均値が提示される。基底ミトコンドリア呼吸、ATPの代謝回転に起因するミトコンドリア呼吸、ミトコンドリアの脱共役呼吸および非ミトコンドリア呼吸。 MT：ミトコンドリア、SRC：スペア呼吸容量、SD：標準偏差、SEM：平均値の標準誤差。結果は/分/胚消費O 2のpmolに提示されます。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
図4。 REPRE基底呼吸と脂質沈着に及ぼす化学物質の曝露のsentative結果（A、B）は側面図でオイルレッドOで染色した50のHPF胚。選択的阻害剤と共にインキュベート胚（B）は、終脳における多くのオイルレッドO染色（矢印）が表示され、ビヒクル処置対照胚と比較して、耳胞（矢印）の下。 （C）の基底呼吸は化学的に処理された胚（群あたりn = 10胚）で約2倍の増加を示しています。結果は、O 2 /分/胚のpmolに示されている。
Discussion
ゼブラフィッシュ胚における遺伝子機能も簡単にブロックされたり、アクティブにすることができながら、ゼブラフィッシュは、前方（ENU誘発）とリバース（耕耘、ジンクフィンガーヌクレアーゼ標的ノックアウト、モルホリノノックダウン）遺伝的アプローチ3,4両方のための十分に確立された遺伝的モデルである符号化された製品の特定の選択的な薬理学的化合物を使用して。彼らの外部の開発と小型のため、ゼブラフィッシュ胚は、代謝解析のために特に適している。しかし、代謝プロフィールとゼブラフィッシュ胚における in vivoでのミトコンドリア機能の堅牢な計測は1つだけ予備説明と共に、達成5報告されていない。タツノオトシゴの分析は、もともと細胞ベースの代謝研究用に設計されており、正確で信頼性の高い結果6を与えることが実証されている。ゼブラフィッシュ胚には、この新しい方法論の適用が重要、と代謝研究のために、このモデルのより広い使用を増強する可能性があります。
そこで本研究では、基底呼吸、最大呼吸、呼吸予備容量は、ATPの代謝回転とプロトンリーク電流を含むタツノオトシゴアナライザーを用いて、ゼブラフィッシュ胚の呼吸パラメータの範囲の測定値を示しています。我々はまた、このような測定は、この場合の脂質の蓄積であり、このアッセイ系における薬理学的阻害剤の使用の他の生理的パラメータと相関させることができる方法の例を提供します。遺伝子組み換え胚の使用と組み合わせることで、これが代謝に影響を与える要因を理解するための強力な実験的なプラットフォームを提供します。
ミトコンドリアの機能不全は、糖尿病7、肥満8、多発性硬化症9、パーキンソン病10、アルツハイマー病11とがん12のいくつかのタイプなど、多くのヒト疾患に関与していると、この新しい方法論のための様々なアプリケーションがあります。重要なことは、Oそれによって生体の呼吸および代謝プロファイルで生理学的に関連するビューを提供する、アクティブになっている-そのようなサイトカイン、開発関連の成長などなど-ウルの仕事はすべての環境の影響は 、in vivo で行われます。などの化学画面も日常的に野生型と変異型の背景ゼブラフィッシュ胚（ 図1）、影響呼吸、ミトコンドリア機能や代謝を簡単にタツノオトシゴ·アナライザを使用して識別することができることを小説医薬品で実行されます。タツノオトシゴ·アナライザを使用して生成された結果は、追加情報を提供するために、他のアッセイと組み合わせて使用することができる。これは、例えばcebpαなどの特定の脂肪細胞のマーカーのためのin situハイブリダイゼーションなどのオイルレッド染色、または分子解析、PPARα、PPARγ、FASなどの生理的な分析を含むことができ、
この方法にはいくつかの制限が残っている。我々と他の人はMEASにオリゴマイシンを使用することができたものの、60 HPFオリゴマイシンの治療よりも古い胚の若い胚5（ 図3を参照）上のURE ATP生産とプロトンリークは、非効率的です。我々は古い胚でオリゴマイシンは、同じように簡単に解釈する結果は不可能若い胚に比べて拡散することができないと信じています。オリゴマイシンの結果は、ATPの代謝回転と切り離さ呼吸による呼吸の測定のための必須であるので、我々は現在、年上の胚のオリゴマイシンの高い濃度を調査している。しかし、アンチマイシン治療法は、このような基礎呼吸、最大呼吸とスペア呼吸容量、古いゼブラフィッシュ胚で行うことができ、最大68 HPF（図示せず）などの他の測定と、より長い有効のままです。
現在のタツノオトシゴアナライザーのセットアップを使用してのもう一つの制限は、ゼブラフィッシュ胚および若齢幼虫にのみ適していることなどを各ウェル膵島捕捉プレート内の物理的な空間です。したがって、metabolを行う成魚における食餌誘導性肥満のICの研究は、例えば、まだ技術的に実現不可能である。しかし、この研究では、ことが可能な分析の範囲を拡張し、特に少年又は成魚用に設計されたプレートの開発を促すことができる。
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、優れた継続的な畜産ケアを提供するためディーキン大学ゼブラフィッシュ施設のスタッフに感謝したいと思います。 YGは、アルフレッドディーキンポスドク研究フェローシップとディーキン大学から中央研究グラントでサポートされています。 SLMはNHMRCキャリア開発フェローシップでサポートされています。 ACWはNHMRC有効にグラントでサポートされています。すべての著者は、ディーキン大学の分子医療研究戦略研究センターによりサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
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