Summary
Sebrafisk representerer en kraftig virveldyr modell som har vært lite benyttet for metabolske studier. Her beskriver vi en rask måte å måle
Abstract
En økende mål innen stoffskiftet er å fastslå effekten av genetikk på ulike aspekter av mitokondrienes funksjon. Forstå disse sammenhengene vil bidra til å forstå den underliggende etiologi for en rekke sykdommer forbundet med mitokondriell dysfunksjon, slik som diabetes og fedme. Nylige fremskritt innen instrumentering, har aktivert overvåkingen av distinkte parametere mitokondriefunksjon i cellelinjer eller vev eksplanter. Her presenterer vi en metode for en rask og følsom analyse av mitokondrie funksjonsparameterne in vivo under sebrafisk embryoutvikling med Seahorse biovitenskap XF 24 ekstracellulære flux analysator. Denne protokollen utnytter Islet Capture mikroplater hvor en enkelt embryo blir plassert i hver brønn, slik at måling av bioenergi, inkludert: (i) basal respirasjon, (ii) basal mitokondrie respirasjon (iii) mitokondrie åndedrett grunnet ATP omsetning, (iv) mitokondriell frikoblet åndedrett eller prOton lekkasje og (iv) maksimum åndedrett. Ved hjelp av denne tilnærmingen embryonale sebrafisk respirasjon parametere kan sammenlignes mellom vill type og genetisk endret embryoer (mutant, genet over-uttrykk eller gene knockdown) eller de manipulert farmakologisk. Det er forventet at formidling av denne protokollen vil gi forskere med nye verktøy for å analysere det genetiske grunnlaget for metabolske forstyrrelser in vivo i dette relevante virveldyr dyremodell.
Protocol
Del 1: Kjemisk behandling av sebrafisk embryo
- Samle sebrafisk embryo etter befruktning. Inkuber ved 28,5 ° C i E3 medium i 100 × 15 mm petriskåler. Merk: For in situ hybridisering eller olje-Rød-O farging, er 1-fenyl-2-tiourea (PTU) ved en endelig konsentrasjon på 0,2 mM tilsatt til hemme pigment formasjonen, 1, men er ikke nødvendig for Seahorse analyse.
- For farmakologiske studier, legge til de nødvendige kjemisk i en passende sluttkonsentrasjon å utvikle sebrafisk embryoer på rundt 26 hr innlegget fertilisering (HPF) med en passende kjøretøy kun kontroll Merk:. For lysfølsomme farmakologiske inhibitorer, kan embryoene tillates å utvikle seg i mørket før analyse.
Del 2: Live Metabolsk profil Bruke Seahorse XF 24 Analyser
- Før hvert løp, Seahorse XF 24 Analyser patron som huser O 2 og H
- Forberedelse av 24-brønners XF 24 holme plate. Følgende eksperimentelle sekvens anvendes:
- Siden oksygenforbruk er følsom for temperaturvariasjoner, er fire brønner brukes til å styre for mulige temperatursvingninger over platen. Disse brønnene inneholder ikke embryoer, men er fylt med 700 pl av E3 medium (figur 2A).
- De resterende 20 brønner (se del 2.2) er fylt med 700 pl av E3 medium og en embryo hver (figur 2B).
- For hvert forsøk blir 10 embryoer behandlet med kjøretøy-bare (kontroll) og 10 behandlet med kjemiske inhibitor (behandlet). Kontroll og behandlet embryoer er vekslet (f.eks godt A2: kontroll embryo, vel A3: behandlet embryo: vel A4: kontroll embryo, vel A5 behandlet embryo, etc).
- En holme fange skjermen legges på toppen av. hver brønn for å sikre at prøven forblir i målekammeret hele analysen (figur 2B) Merk: kjemisk-behandlede embryoer forbli med sin opprinnelige kjemiske løsning gjennom hele prosedyren, uten behov for å vaske ut den kjemiske forutgående kjører Seahorse analysator program.
- Når ferdig, er platene lastet inn Seahorse Analyser og analysen startes.
- Analyse av prøver. To forskjellige analysene er rutinemessig utført.
- Basal respirasjon / Maksimal åndedrett program (varighet ca. 90 min). Endringer i basal respirasjon underbygge metabolsk dysfunksjon, mens maksimal respirasjon er et mål for total energi produksjonskapasitet og endringer i denne parameteren forbundet med en rekke av både patologisk og fysiologiske tilstander. Reservedeler respiratoriske kapasitet, eller kapasiteten for systemet å øke ATP produksjon, blir også beregnetfra denne testen ved subtraksjon av basal fra maksimal respirasjon. Tre gjentakelser av hver blanding (2 min) / vente (1 min) / måling (2 min) syklusen utføres å først etablere basal åndedrett. På slutten av den tredje syklus, blir en endelig konsentrasjon på 2,5 uM av FCCP (mitokondrisk protonophore / uncoupler) tilsatt til hver brønn slik at måling av maksimal åndedrett. Målesyklusen gjentas 5-8 ganger (fig. 3).
- ATP omsetning / Proton lekkasje program (varighet ca. 60 min). Respirasjon grunnet ATP omsetningen utgjør den viktigste funksjon av mitokondrier i form av ATP produksjon, mens respirasjon grunnet proton lekkasje eller ukoblet respirasjon, er uløselig forbundet med andre parametere av mitokondriefunksjon inkludert basal respirasjon og reaktive oksygen artsdannelse. Respirasjon grunnet ATP omsetningen er representert ved forskjellen i åndedrett etter tillegg av 25 pM oligomycin (en inhibitor av ATP syntase) sammenlignet til basal åndedrett. Ukoplet respirasjon eller respirasjon grunnet proton lekkasje, bestemmes ved å beregne differansen mellom oligomycin-mediert respirasjon og respirasjon etter tillegg av 25 pM rotenon (en kompleks I-inhibitor). Målesykluser gjentas 8 ganger etter tilsetning av hver mitokondrie inhibitor.
- Forberedelse av 24-brønners XF 24 holme plate. Følgende eksperimentelle sekvens anvendes:
På slutten av traseen, middelverdier av 10 kontroll og 10 kjemisk behandlede embryoer beregnes.
Del 3: Olje-Red-O Farging
- Embryoer ved 50 HPF er dechorionated bruke fine pinsett og fiksert i 4% PFA natten ved 4 ° C.
- Olje-Rød-O farging utføres, som tidligere beskrevet 2 (se figur 4).
Representative Results
Vi er interessert i å forstå rollen spesifikke gener på stoffskiftet, særlig pusterytme og lipidmetabolismen. Derfor, behandlet vi villtype sebrafisk embryoer fra 26 HPF utover med en spesifikk farmakologisk hemmer av enzymet kodet av en av disse genene. Ved 50 HPF, var halvparten av kjøretøyet og inhibitor-behandlede embryoer analysert med Seahorse for mitokondriefunksjon, mens den resterende halvdel ble fiksert i 4% PFA natten ved 4 ° C, og deretter farget for lipid deponering med Oil-Rød-O. Behandling med den spesifikke enzym inhibitor ledet et ~ 2 ganger økning i basal respirasjon (figur 4A), som var forbundet med en økning i lipid deponering spesielt i telencephalon og under otisk vesikkel (figur 4B, C).
pload/4300/4300fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk fremstilling av kjemisk behandling av sebrafisk embryo. Wildtype, genetisk-manipulerte, eller farmakologisk behandling sebrafisk embryo er bakgrunnen.
Figur 2. XF24 holme plate satt opp. (A) Fire brønner inneholder embryonale medium bare som temperaturkontroll (merket med en X) og de andre inneholder ett embryo / brønn. (B) Nærbilde av en brønn (C6) viser en 50 HPF villtype embryo behandlet med kjøretøy (DMSO) dekket av en holme fange skjermen (pilspiss).
Figur 3. Respiration parametere for vill-type 50 HPF sebrafisk embryo. (A) For hver måling, er gjennomsnittet av de 20 individuelle embryo presentert. Basal respirasjon (Mean: 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), Maximal respirasjon (Mean: 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), Spare Respiratory Kapasitet (Mean: 87,7, SD: 72,0; SEM: 16,1). (B) For hver måling, er gjennomsnittet av de 20 individuelle resultatene presentert. Basal mitokondrie respirasjon; mitokondrie åndedrett grunnet ATP omsetning; mitokondrie ukoblede respirasjon og ikke-mitokondrie åndedrett. Mt: mitokondrielle; SRC: Spare Respiratory Kapasitet, SD: Standard Avvik, SEM: Standard Feil i Mean. Resultatene presenteres i pmol av O 2 forbrukes / min / embryo. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Representererrepresentativt resultat av kjemisk eksponering på basal respirasjon og lipid deponering. (A, B) 50 HPF embryo farget med Olje-Red O i lateral utsikt. Embryo inkuberes med selektiv inhibitor (B) viser mer Olje-Rød-O farging i telencephalon (pilspiss) og under otisk vesikkel (pil) sammenlignet med et kjøretøy-behandlet kontroll embryo. (C) Basal respirasjon viser en ~ 2 ganger økning i kjemisk behandlede embryoer (n = 10 embryoer pr gruppe). Resultater er presentert i pmol av O 2 / min / embryo.
Discussion
Sebrafisk er et veletablert genetisk modell for både forover (ENU mutagenese) og revers (Tilling, sink finger nuklease målrettet knock-out, morfolino knockdown) genetiske tilnærminger 3,4, mens gen-funksjon hos sebrafisk embryo kan også lett blokkert eller aktivert hjelp selektive farmakologiske forbindelser som er spesifikke for de kodede produkter. På grunn av deres ytre utvikling og liten størrelse, sebrafisk embryoer er særlig egnet for metabolsk analyse. Imidlertid har robust måling av metabolsk profil og mitokondriell funksjon in vivo i sebrafisk embryoer ikke blitt oppnådd, med bare én foreløpige beskrivelse rapporterte 5. Sjøhest analyse ble opprinnelig utviklet for celle-baserte metabolske studier og har vist seg å gi nøyaktige og pålitelige resultater 6. Anvendelsen av denne nye metodikken til sebrafisk embryo er betydelig, og sannsynligvis forsterke bredere bruk av denne modellen for metabolske studier.
I denne studien, viser vi måling av en rekke respirasjon parametere i sebrafisk embryo ved hjelp av Seahorse Analyser, inkludert basal respirasjon, maksimal respirasjon, reservedeler luftveiene kapasitet, ATP omsetning og proton lekkasje. Vi har også et eksempel på hvordan slike målinger kan være korrelert med andre fysiologiske parametere, i dette tilfellet fettakkumulering, og ved bruk av farmakologiske inhibitorer i denne assaysystem. Kombinert med bruk av genetisk endrede embryoer, gir dette en kraftig eksperimentell plattform for å forstå faktorer som påvirker på stoffskiftet.
Det finnes en rekke anvendelser for denne nye metode, med mitokondriell dysfunksjon er innblandet i mange menneskelige sykdommer, slik som diabetes 7 mellitus, fedme 8, multippel sklerose 9, Parkinsons sykdommer 10, Alzheimers sykdom 11 og noen type kreft 12. Viktigere, our arbeidet utføres in vivo, der alle miljømessige påvirkninger - for eksempel cytokiner, utviklingsrelatert vekst osv - er aktive, og dermed gi en fysiologisk relevant visning in vivo åndedrett og metabolsk profil. Som kjemiske skjermer er også rutinemessig utført i villtype og mutant bakgrunn sebrafisk embryo (figur 1), roman legemidler som påvirker respirasjon, mitokondrier funksjon eller metabolisme kan lett identifiseres ved hjelp av Seahorse analysator. Resultatene som genereres ved hjelp av Seahorse analysator kan brukes i forbindelse med andre analyser for å gi ytterligere informasjon. Dette kan omfatte fysiologisk analyse, for eksempel olje-Red Staining eller molekylær analyse, for eksempel in situ hybridisering for spesifikke adipocyte markører som cebpα, Pparα, Pparγ, FAS etc.
Det gjenstår noen begrensninger i denne metodikken. Selv om vi og andre var i stand til å bruke oligomycin til tiltakure ATP produksjon og proton lekkasje på unge embryoer 5 (se figur 3), i embryoer eldre enn 60 HPF oligomycin behandling er ineffektiv. Vi tror at i eldre embryoer oligomycin ikke kan spres så lett enn hos yngre embryoer gjør resultatene umulig å tolke. Siden oligomycin resultatene er obligatorisk for bestemmelse av åndedrett grunn ATP omsetning og ukoblet åndedrett, er vi nå undersøker høyere konsentrasjoner av oligomycin for eldre embryoer. Imidlertid antimycin behandlinger forblir effektive lenger, med andre målinger, slik som basal respirasjon, maksimal respirasjon og reservedeler respiratorisk kapasitet, kan utføres i eldre sebrafisk embryoer, opptil 68 HPF (ikke vist).
En annen begrensning i bruk av nåværende Seahorse Analyser oppsett er den fysiske plassen innenfor hver holme fangst plate også, slik at de er kun egnet for sebrafisk embryo og unge larver. Derfor utfører metabolic studier på diett-indusert fedme i voksen fisk, for eksempel, er ikke ennå teknisk gjennomførbart. Imidlertid kan denne studien be utviklingen av platene spesielt utformet for juvenile eller voksen fisk, derved å utvide omfanget av analyser mulige.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke de ansatte medlemmer av Deakin University Sebrafisk Facility for å gi utmerket pågående dyrehold omsorg. YG er støttet av en Alfred Deakin Postdoktor Research Fellowship og Central Research Grant fra Deakin University. SLM er støttet av en NHMRC Career Development Fellowship. ACW er støttet av en NHMRC Aktivere Grant. Alle forfatterne støttes av molekylær og medisinsk forskning Strategic Research Centre ved Deakin University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).
- Ingham, P. W. The power of the zebrafish for disease analysis. Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development. Plos One. 6, e25652 (2011).
- McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics. Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).
- Sivitz, W. I., Yorek, M. A. Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities. Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).
- Bournat, J. C., Brown, C. W. Mitochondrial dysfunction in obesity. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).
- Ghafourifar, P., et al. Mitochondria in multiple sclerosis. Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Maruszak, A., Zekanowski, C. Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).
- de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer. Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).
