Summary
Metabolik çalışmalar için-kullanılan altında olmuştur güçlü bir omurgalı modeli temsil zebrafish. Burada ölçmek için hızlı bir şekilde tarif
Abstract
Metabolizma alanında büyüyen bir gol mitokondriyal fonksiyon farklı yönleri üzerine genetiğin etkisini belirlemektir. Bu ilişkileri anlamak, diyabet ve obezite gibi mitokondriyal disfonksiyon ile bağlantılı hastalıkların bir dizi için altta yatan neden anlamanıza yardımcı olacaktır. Enstrümantasyon son gelişmeler, hücre hatları veya doku eksplantlar mitokondriyal fonksiyon farklı parametrelerin izlenmesi sağladı. Burada Denizatı biyobilim XF 24 ekstraselüler akı analizörü kullanılarak zebrafish embriyonik gelişim sırasında in vivo mitokondriyal fonksiyon parametrelerinin hızlı ve duyarlı bir analizi için bir yöntem mevcut. Bu protokol Islet Yakalama tek bir embriyo her bir kuyunun yer nerede, biyoenerjetik ölçümü sağlayan mikropleytin dahil kullanır: bazal solunum (i); ATP ciro nedeniyle (ii) bazal mitokondriyal solunum (iii) mitokondriyal solunum; (iv) mitokondriyal Kuplajsız solunum veya prOton sızıntı ve (iv) maksimum solunum. Bu yaklaşım, embriyonik zebrafish solunum parametreleri kullanarak yabani tip ve genetiği değiştirilmiş embriyolar (mutant gen aşırı ekspresyonu veya gen demonte) veya farmakolojik olarak manipüle olanlar arasında mukayese edilebilir. Bu protokol yayılması bu alakalı omurgalı hayvan modelinde in vivo metabolik bozuklukların genetik temeli analiz için yeni araçlar ile araştırmacılar sağlayacağı tahmin edilmektedir.
Protocol
Bölüm 1: Zebra balığı Embriyolar Kimyasal Arıtma
- Döllenmeden sonra zebrafish embriyolar toplayın. 28.5 inkübe 100 ° E3 orta C x 15 mm Petri kapları Not:. Için in situ hibridizasyon ya da yağ-kırmızı O boyama içinde, 0.2 mM nihai bir konsantrasyonda 1-fenil-2-tioüre (PTU) ilave edilir pigment oluşumu, 1 ama Seahorse analiz için gerekli değildir inhibe ederler.
- . Farmakolojik çalışmalar için uygun bir araç sadece kontrol Not 26 civarında saat sonrası fertilizasyon (HPF) de zebrafish embriyo geliştirmek için uygun bir final konsantrasyonda gerekli kimyasal ekleyin: ışığa duyarlı farmakolojik inhibitörleri için, embriyo geliştirmek için izin verilebilir analiz karanlık öncesinde.
Bölüm 2: Denizatı XF 24 Analizörü Kullanma Canlı Metabolik Profili
- Her çalışma öncesinde, Denizatı XF 24 Analizcisi kartuşu O 2 ve H evler olduğunu
- 24-kuyu XF 24 adacık plaka hazırlanması. Aşağıdaki deney sırası kullanılmaktadır:
- Oksijen tüketimi sıcaklık dalgalanmalarına karşı duyarlı olduğu için, dört kuyu plakası üzerinde olası sıcaklık değişimleri kontrol etmek için kullanılır. Bu kuyular embriyolar içermez, ancak E3 orta 700 ul (Şekil 2A) ile doldurulur.
- Kalan 20 kuyu (bölüm 2.2 'ye bakınız) E3 orta ve tek embriyo her (Şekil 2B) 700 ul ile doldurulur.
- Her deney için, 10 embriyolar araç-sadece (kontrol) ve 10 kimyasal inhibitörü (tedavi) ile tedavi ile tedavi edilir. Kontrol ve tedavi embriyolar (:;: işlenmiş embriyo: sıra A4: Kontrol embriyo; sıra A5 tedavi embriyo, vb de A3 kontrolü embriyo sıra A2 gibi) alternated vardır.
- Bir adacık yakalama ekranın üstüne eklenir. numune tahlil boyunca ölçüm bölmesine (Şekil 2B) kalmasını sağlamak için her bir kuyunun Not: kimyasal işlem görmüş embriyolar önceden Denizatı analizörü çalıştıran kimyasal yıkamak gerek kalmadan, tüm prosedür boyunca orijinal kimyasal solüsyonu ile devam programı.
- Bittiği zaman, plaka Denizatı Analizörü yüklenir ve tahlil başlatılır.
- Numunelerin analizi. İki farklı testler rutin olarak yapılmaktadır.
- Bazal solunum / Maksimum solunum programı (süresi yak. 90 dk). Maksimal solunum patolojik ve fizyolojik hem de devletlerin bir dizi ile ilişkili bu parametrede toplam enerji üretim kapasitesi ve değişikliklerin bir ölçü ise bazal solunum değişiklikler, metabolik disfonksiyon destekleyecektir. Yedek solunum kapasitesi, ya da daha fazla ATP üretimi artırmak için sistem için kapasite, aynı zamanda hesaplanırmaksimal solunum gelen bazal çıkarma bu testi. Üç Her karışım tekrarlar (2 dak) / bekleme (1 dak) / ölçüm (2 dk) döngüsünün ilk bazal solunum kurmak için yapılır. Üçüncü çevrimi sonunda, FCCP 2.5 uM (mitokondrial protonophore / uncoupler) bir son konsantrasyon iyi maksimum solunum ölçümüne izin veren her eklenir. Ölçüm işlemi, daha sonra 5-8 kez (Şekil 3) tekrarlanır.
- ATP ciro / Proton sızıntısı programı (süresi yak. 60 dk). Proton sızıntısı ya da bağlanmamış solunum bağlı solunum, ayrılmaz bazal solunum ve reaktif oksijen türlerinin oluşumunu içeren mitokondriyal işlev diğer parametreleri ile bağlantılı iken ATP devir bağlı solunum, ATP üretimi şeklinde mitokondri temel fonksiyonu temsil etmektedir. Nedeniyle ATP devir için solunum 25 uM oligomycin ve buna ek olarak (A inhibitörü aşağıdaki solunum arasındaki fark ile temsil edilirTP sentaz) bazal solunum ile karşılaştırıldığında. Bağlanmamış solunum ya da proton sızıntı nedeniyle solunum, 25 uM rotenon (bir kompleks I inhibitörü) ve buna ek olarak aşağıdaki oligomycin-aracılı, solunum ve solunum arasındaki farkı hesaplayarak belirlenir. Ölçüm döngüleri her mitokondriyal inhibitörü eklenmesinden sonra 8 kez tekrarlanır.
- 24-kuyu XF 24 adacık plaka hazırlanması. Aşağıdaki deney sırası kullanılmaktadır:
Ishal sonunda, 10 ve 10 kontrol kimyasal işlem görmüş embriyoların ortalama değerleri hesaplanır.
Bölüm 3: Petrol-Kırmızı-O Boyama
- 50 hpf az Embriyolar 4 ° C gecede% 4 PFA ince forseps kullanarak dechorionated ve sabitlenmiştir
- Daha önce (bkz. Şekil 4) 2 açıklandığı gibi Petrol-Kırmızı-O boyama, gerçekleştirilir.
Representative Results
Biz özellikle metabolizma, solunum hızı ve lipid metabolizması üzerine rolü belirli genleri anlamakla ilgilenen. Bu nedenle, bu gen tarafından kodlanan bir enzim, belirli bir farmakolojik inhibitör ile 26 hpf itibaren vahşi tip zebrafish embriyolar tedavi edildi. Yarım kalan% 4'lük sabit iken 50 hpf, araç ve inhibitörü ile tedavi edilen embriyoların yarısı, mitokondriyal fonksiyon için Denizatı kullanılarak analiz edildi PFA 4 gecede ° C ve daha sonra Petrol-Kırmızı-O ile lipid birikimi için boyandı. Spesifik enzim inhibitörü ile tedavi özellikle telencephalon ve otik vezikül (Şekil 4B, C) altında lipid birikimi bir artış ile ilişkili olduğu bazal solunum bir ~ 2 kat artış (Şekil 4A), açtı.
pload/4300/4300fig1highres.jpg "/>
Şekil 1. Zebrafish embriyolar kimyasal arıtma şematik gösterimi. Yabani-tip, genetik manipüle veya farmakolojik tedavi zebrafish embriyo arka plan vardır.
Şekil 2. XF24 adacık plaka kurdu. (A) Dört kuyularının yalnızca sıcaklık kontrolü gibi embriyonik ortamı içeren (X ile işaretlenmiş) ve diğerleri / iyi bir embriyo içerir. (B) Close-up bir adacık yakalama ekranı (ok başı) kapsadığı araç (DMSO) ile tedavi edilen 50 hpf vahşi tip embriyo gösteren iyi bir (C6).
Şekil 3,. Respiratvahşi tip 50 hpf zebrafish embriyolar için iyon parametreleri. (A) Her bir ölçüm için, 20 bireysel embriyoların ortalama sunulmuştur. Bazal solunum (ortalama: 299.7, SS: 75.7; SEM: 16.9), maksimal solunum (ortalama: 387,4; SD: 93.3; SEM: 20.9), Yedek Solunum Kapasitesi (ortalama: 87.7, SS: 72.0; SEM: 16.1). (B) her ölçüm için, 20 tek sonuçların ortalaması gösterilmiştir. Bazal mitokondrial solunum; mitokondriyal Kuplajsız solunum ve non-mitokondrial solunum; ATP ciro nedeniyle mitokondriyal solunum. Mt: mitokondrial; SRC: Yedek Solunum Kapasite; SD: Standart sapma, SEM: Ortalama Standart Hatası. Sonuçlar O 2 pmol sunulmuştur tüketilen / dak / embriyo. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Reprebazal solunum ve lipid birikimi üzerine kimyasal maddelere maruz kalma temsilsici sonuçlar. lateral görünümde Petrol-Red O ile boyandı (A, B) 50 hpf embriyo. Selektif inhibitörü (B) ile inkübe embriyo bir araç-tedavi edilen kontrol embriyo ile karşılaştırıldığında telencephalon (ok başı) ve otik vezikül (ok) altında daha fazla yağ-Kırmızı-O boyama görüntüler. (C) Bazal solunum kimyasal tedavi embriyoların (grup başına n = 10 embriyo) bir ~ 2 kat artış gösterir. Sonuçlar O 2 / dak / embriyo pmol sunulmuştur.
Discussion
Zebrafish embriyolar gen işlevi de kolayca bloke veya aktive edilebilir ise Zebra balığı, ileri (TRK mutagenez) ve ters (Tilling, çinko parmak nükleaz hedefli knock-out, morfolino demonte) genetik yaklaşımlar 3,4 hem de köklü bir genetik modeldir kodlanmış ürünler için özel seçici farmakolojik bileşiklerin kullanılması. Dış gelişimi ve küçük boyutları nedeniyle, zebrafish embriyolar metabolik analizi için özel olarak uygundur. Bununla birlikte, metabolik profil ve zebrafish embriyolar in vivo olarak mitokondriyal fonksiyonun sağlam ölçüm sadece bir ön tanımlama ile, elde 5 rapor edilmemiştir. Denizatı analizi aslında hücre tabanlı metabolik çalışmalar için dizayn edilmiştir ve doğru ve güvenilir sonuçlar 6 vermesi ispat edilmiştir. Zebrafish embriyolar bu yeni metodolojinin uygulama önemli ve metabolik çalışmalar için bu model daha geniş kullanımını artırmak için muhtemeldir.
Bu çalışmada, bazal solunum, maksimal solunum, yedek solunum kapasitesi, ATP ciro ve proton kaçak dahil Denizatı Analizörü kullanılarak zebrafish embriyolar solunum parametreleri bir dizi ölçüm göstermektedir. Ayrıca, bu tür ölçümleri bu durumda lipid birikimi, ve bu test sisteminde kullanılan farmakolojik inhibitörlerinin kullanımı diğer fizyolojik parametreler ile korele edilebilir bir örnek sağlamaktadır. Genetiği değiştirilmiş embriyoların kullanımı ile birlikte bu metabolizma üzerine etkileyen faktörleri anlamak için güçlü bir deneysel bir platform sağlar.
Mitokondriyal işlev bozukluğu, diyabet mellitus, 7, 8 şişmanlık, multipl skleroz 9, Parkinson hastalıkları 10, Alzheimer hastalığı ve 11 kanserler 12 bir tür olarak pek çok insan hastalığı, karıştığı birlikte bu yeni yöntem için çeşitli uygulamalar vardır. Önemlisi, oböylece vivo solunum ve metabolik profilde önemli fizyolojik görünüm sağlayan, aktif - gibi sitokinler, kalkınma ile ilgili büyüme vb - ur tüm çalışmaları çevresel etkiler in vivo koşullarda gerçekleştirilir. Kimyasal ekranlarında ayrıca rutin vahşi tip ve etkisi solunum, mitokondri fonksiyonu veya metabolizma kolayca Denizatı analyzer kullanarak teşhis edilebileceğini mutant arka zebrafish embriyolar (Şekil 1), yeni ilaç yapılır gibi. Seahorse analizör kullanılarak oluşturulan sonuçlar ek bilgi sağlamak için başka deneyler ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Bu tür tür cebpα, Pparα gibi belirli adiposit belirteçleri için in situ hibridizasyon gibi Petrol-Kırmızı Boyama gibi fizyolojik analizi, veya moleküler analizi, PPARy, FAS vb içerebilir
Bu yöntem için bazı sınırlamalar vardır kalır. Biz ve diğerleri ölçüm için oligomycin kullanmak mümkün olmasına rağmengenç embriyoların 60 hpf oligomycin tedavisi daha yaşlı embriyolar 5 (bkz. Şekil 3), üzerine ure ATP üretimi ve proton kaçak verimsiz. Biz yaşlı embriyolar oligomycin gibi kolayca yorumlamak sonuçları imkansız hale genç embriyoların daha yaygın olamaz inanıyoruz. Oligomycin sonuçlar ATP ciro ve bağlantısız solunum nedeniyle solunumun belirlenmesi için zorunlu olduğundan, şu anda eski embriyolar oligomycin yüksek konsantrasyonlarda araştırıyoruz. Bununla birlikte, bu gibi tedaviler antimycin bir bazal solunum, maksimum solunum ve yedek solunum kapasitesi, büyük zebrafish embriyolar yapılabilir, en fazla 68 HPF (gösterilmemiştir) gibi diğer ölçümleri ile, daha uzun etkili olmaya devam etmektedir.
Geçerli Denizatı Analizörü kurulumu kullanarak diğer sınırlılığı da zebrafish embriyolar ve genç larvalar için uygundur böyle de her adacık yakalama plaka içinde fiziksel alandır. Bu nedenle, metabolizma icrayetişkin balık diyete bağlı aşırı şişmanlık üzerinde ic çalışmalar, örneğin, henüz teknik olarak mümkün değildir. Ancak, bu çalışmada böylece olası analizleri kapsamında uzanan, özellikle çocuk ve yetişkin balık için tasarlanan plaka gelişimini teşvik edebilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar mükemmel sürekli hayvancılık bakım sağlamak için Deakin Üniversitesi Zebrafish Tesisi personeli teşekkür etmek istiyorum. YG Alfred Deakin Doktora Sonrası Araştırma Bursu ve Deakin Üniversitesi'nde Merkez Araştırma Grant tarafından desteklenmektedir. SLM bir NHMRC Kariyer Geliştirme Bursu tarafından desteklenmektedir. ACW bir NHMRC etkinleştirilmesi Grant tarafından desteklenmektedir. Tüm yazarlar Deakin Üniversitesi'nde Moleküler ve Tıbbi Araştırma Stratejik Araştırma Merkezi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).
- Ingham, P. W. The power of the zebrafish for disease analysis. Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development. Plos One. 6, e25652 (2011).
- McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics. Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).
- Sivitz, W. I., Yorek, M. A. Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities. Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).
- Bournat, J. C., Brown, C. W. Mitochondrial dysfunction in obesity. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).
- Ghafourifar, P., et al. Mitochondria in multiple sclerosis. Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Maruszak, A., Zekanowski, C. Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).
- de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer. Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).
