Her beskriver vi en fremgangsmåde til aktivering og udvide humane NKT-celler fra bulk T-cellepopulationer med kunstige antigenpræsenterende celler (AAPC). Anvendelsen af CD1d-baseret AAPC tilvejebringer en standardiseret fremgangsmåde til generering af et stort antal funktionelle NKT-celler.
Naturlige dræber T (NKT) celler er en unik undergruppe af T-celler, der viser markører der er karakteristiske for både naturlig dræber (NK)-celler og T-celler 1. Ulig klassiske T-celler, genkender NKT-celler lipid-antigen i forbindelse med CD1-molekyler 2. NKT-celler udtrykker en invariant TCRα kæde omlejring: Vα14Jα18 i mus og Vα24Jα18 hos mennesker, som er associeret med Vp-kæder af begrænset diversitet 3-6, og omtales som kanoniske eller invariant NKT (i NKT) celler. Ligesom konventionelle T-celler, NKT-celler udvikler sig fra CD4-CD8-thymus-precursor-T-celler efter passende signalering ved CD1d 7. Potentiale til at udnytte NKT-celler til terapeutiske formål er signifikant forøget med evnen til at stimulere og øge humane NKT-celler med α-galactosylceramid (α-GalCer) og en række cytokiner 8. Vigtigt, disse celler bevarede deres oprindelige phenotype, secernerede cytokiner og vises cytotoksiske funktion mod tumorcellelinier. Således ex vivo ekspanderede NKT-celler forbliver funktionelle og kan anvendes til adoptiv immunterapi. Imidlertid har NKT cellebaseret-immunterapi blevet begrænset af anvendelsen af autologe antigenpræsenterende celler, og mængden og kvaliteten af disse stimulatorceller kan variere betydeligt. Monocyt-afledte DC fra cancerpatienter er rapporteret at udtrykke reducerede niveauer af costimulerende molekyler, og producerer mindre inflammatoriske cytokiner 9,10. Faktisk har murine DC stedet for autolog APC blevet anvendt til at teste funktionen af NKT-celler fra CML-patienter 11. Imidlertid kan dette system kun anvendes til in vitro testning, da NKT-celler ikke kan udvides med murine DC og derefter anvendes til adoptiv immunterapi. Således kunne et standardiseret system, der er baseret på kunstige antigenpræsenterende celler (AAPC) producerer de stimulerende virkninger af DC uden faldgruberne i allo-eller xenogent ceLLS 12, 13. Heri, beskriver vi en fremgangsmåde til frembringelse af CD1d-baseret AAPC. Eftersom indgrebet af T-cellereceptoren (TCR) efter CD1d-antigenkomplekser er et grundlæggende krav for NKT celleaktivering, antigen: CD1d-Ig-komplekser tilvejebringe en pålidelig fremgangsmåde til at isolere, aktivere og udvide effektor NKT cellepopulationer.
AAPC kan anvendes til undersøgelse af de grundlæggende krav for NKT-celleaktivering og det har potentielle kliniske værdi for ex vivo-ekspansion af NK-T-celler til adoptiv immunterapi. Mescher et al. Beskrev et af de første perle-baserede systemer, hvor biotinyleret murint MHC klasse I-peptid-enkeltkædede konstruktioner blev kombineret med biotinylerede costimulerende molekyler B7.1 og B7.2 via streptavidin til overfladen af latex mikrosfærer 14, 15. Denne fremgangsmåde er med held blevet anvendt til at stimulere antigenspecifikke T-celler fra transgene mus. Desuden, eftersom denne fremgangsmåde anvender et enkeltkædet MHC-peptidkomplekset for at sikre homogen belastning af MHC-molekyler De enkelte mål peptidantigen kræve en ny transfektion til ekspression af det ønskede enkeltkædede MHC-peptid-komplekset, hvilket begrænser anvendelsen af det fremgangsmåde. Vigtigere er det, Dr. Schneck gruppe pioner perlen based-AAPC ved at udvikle en anden ikke-cellulær perle baserede AAPC, Fremstillet ved kobling af HLA-Ig, signal 1, og anti-CD28, signal 2, på magnetiske kugler. HLA-Ig, en unik multimer form af HLA fusioneret til et immunglobulin molekylær stillads 16, 17 er udviklet af hans gruppe. Efterfølgende udviklede de MHC-Ig baseret AAPC, som har vist sig effektivt at udvide CMV og MART-1-specifik CTL 18. Her har vi vist, at CD1d-Ig-baserede AAPC kan bruges til at udvide funktionelle NKT-celler. Et studie har anvendt et lignende system til at undersøge den fysiske interaktion af NK-celler med CD1d 19.
Især har vi designet et kunstigt antigenpræsenterende celle, som kan tilpasses ethvert krav, vi finder nødvendige for optimal NKT celleproliferation. Den AAPC ekspansion metode giver en enkel og pålidelig metode til at udvide og berige humane NKT-celler. Vores AAPC kan modificeres systematisk at vurdere rollen af en række potentielle costimulerende molekyler og vurdere deres rolle på NKT-celle spredtion og funktion. Således AAPC et rimeligt alsidig teknologi anvendes til induktion og udvide NKT-celler. Frembringelsen af aAPCs tager mindre end en uge og er egnet til fremstilling af store mængder perler. En kritisk trin i frembringelse af AAPC er at bekræfte, CD1d-Ig stabilt er immobiliseret på overfladen af kuglerne, og for at vurdere deres funktion at sikre konsistens fra batch til batch. En potentiel begrænsning ved systemet er, at der ikke er en mekanisme til at slå stimulation, bortset fra mekanisk fjernelse af perlerne. Specifikt indgrebet af T-cellereceptoren (TCR) med antigenet: CD1d/MHC komplekset typisk genererer den immunologiske synapser i forståelse med accessoriske / adhæsionsmolekylerne, som kan resultere i induktion af hæmmende eller undertrykkende faktorer på både T-celle og antigen-præsenterende celle. I AAPC systemet, kan disse faktorer være opreguleret af T-cellen, men vulsten vil ikke udtryk for beslægtede liganderfor disse receptorer.
Desuden er CD4 + NKT-celler vist sig at undertrykke antitumor-reaktioner i mus og mennesker, derfor er det muligt, at ikke-selektive aktivering af alle NKT-celler (dvs. global stimulering med α-GalCer) eller aktivering af den forkerte delmængde kan medføre uønskede immunologiske resultater. Derfor skal man fænotypisk og funktionelt karakterisere AAPC-ekspanderet NKT cellepopulation. Som vist i figur 4, har vi fundet, at stimulering med α-GalCer-loaded AAPC udtrykker anti-CD28 kan resultere NKT-celler, der producerer Th1, Th2-og Th17 type cytokiner. Murine undersøgelser har rapporteret, at udfordringen med IL-33, et for nylig identificeret cytokin, resulterede i øgede niveauer af cirkulerende inflammatoriske cytokiner, såsom IL-5 og IL-13. Behandling af NKT-celler med IL-33 øget deres cytokinproduktion 20. IL-33 er en specifik ligand for ST2 og det er blevet vist, at opløselig ST2 can blok IL-33 signalering. Således, som et eksempel på en fremtidig anvendelse, kan AAPC udtrykker ST2 genereres og anvendes til at bestemme, om man selektivt kan inhibere produktionen af Th2-cytokiner, samtidig med at inducere Th1-cytokin-sekretion af NKT-celler. Det er også blevet rapporteret, at intravenøs injektion af Kb-udtrykkende AAPC i C57BL / 6 mus resulterede i reduceret lunge metastase af tumoren 21. Vigtigt, disse data, at AAPC trafik til lungen og er i stand til at aktivere effektor-T-celledelmængder. Derfor kunne man generere flere typer af AAPC og undersøge samspillet mellem antigen specifikke T-celle delmængder. For at opsummere, disse undersøgelser viser, at CD1d-Ig-baserede AAPC kan anvendes til at erstatte normal cellulær APC, og har på muligheden for at forbedre de nuværende kliniske tiltag for NKT cellebaseret-adoptiv immunterapi.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Priyanka Subrahmanyam for personer diskussioner. Forfatterne har ingen konkurrerende økonomisk interesse. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den amerikanske Cancer Society, NIH / NCI K01 CA131487, R21 CA162273, R21 CA162277, og P30 tumorimmunologi og Immunterapi Program til TJ Webb. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Cancer Institute eller National Institutes of Health.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17-1440 | |
EasySep Human T Cell Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19051 | |
Allophycocyanin CD161 human mAb | Pharmingen | 550968 | |
EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
Anti-mouse IgG1 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-101 | |
Dimer XI Recombinant Soluble Dimeric Mouse CD1d:IG Fusion Protein | BD Biosciences | 557599 | |
Anti-CD28 mAb | Biolegend | 302914 | |
M-450 Epoxy beads | Life Technologies | 150-11 | |
Alpha-galactosylceramide (KRN7000) | Axxora, LLC | BML-SL232-0100 | |
RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R 0883 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Vitamin Solution | Gibco | 11120-052 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | ||
Ciprofloxacin | Alexis Biochemicals | 380-288-G025 | |
PE-Vα24Jα18 | Biolegend | 342904 | |
PE-Vα24 (Clone C15) | Beckman Coulter | A66907 | |
FITC-Vβ11 (Clone C21) | Beckman Coulter | A66905 | |
PE-CD1d | Biolegend | 123510 | |
PE anti mouse IgG1 | BD Biosciences | 556650 | |
FITC anti-mouse IgG2a | Biolegend | 407105 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190250 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S8032 | |
Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440-00100 | |
EDTA | Sigma Aldrich | 431788 | |
IL-2 (Proleukin) | BD Biosciences | 354043 | |
Human AB Serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
Labquake Tube Rotator | Fisher Scientific | 13-687-10Q | |
BD Falcon 5 ml polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
Wheaton Glass Sample Vials with Cap | Fisher Scientific | Small (03-343-6A ) Large (03-343-6E) |