Summary
ここでは、人工抗原提示細胞（AAPC）を使用してバルクT細胞集団から、ヒトNKT細胞を活性化し、拡大するための方法を説明します。 CD1dのベースAAPCの使用は、機能的なNKT細胞の高い数値を生成するための標準化された方法を提供します。
Abstract
ナチュラルキラーT（NKT）細胞は、ナチュラルキラー（NK）細胞やT細胞1の両方の特徴的なマーカーが表示され、T細胞のユニークなサブセットです。古典的T細胞とは異なり、NKT細胞はCD1分子2のコンテキストで脂質抗原を認識する。 NKT細胞は、不変のTCRα鎖転位表現：ヒト、マウスにおけるVα14Jα18とVα24Jα18、限られた多様性3-6Vβチェーンに関連付けられているため、正規または不変のNKT（ⅰNKT）細胞と呼ばれています。従来のT細胞と同様に、NKT細胞は、CD1dの7による適切なシグナリング以下、CD4-CD8-胸腺T前駆細胞から発生する。治療目的のためにNKT細胞を活用する可能性は大幅にα-ガラク（α-トシルセラミド）やサイトカイン8の様々なヒトNKT細胞を刺激して展開する能力を増加している。重要なのは、これらの細胞は元phenotypを保持電子、分泌されるサイトカイン、腫瘍細胞株に対する細胞傷害機能表示。このように、ex vivoで展開されたNKT細胞が機能していると、養子免疫療法に使用することができます。しかし、NKT細胞ベース - 免疫療法は、自己抗原提示細胞の使用によって制限されており、これらの刺激細胞の量と質は大幅に異なる場合があります。癌患者由来の単球由来のDCは共刺激分子のレベル低下を発現し、9,10未満炎症性サイトカインを産生することが報告されている。実際には、むしろ自己のAPCよりマウスDCは、CML患者11からNKT細胞の機能をテストするために使用されている。 NKT細胞がマウスDCによって展開してから、養子免疫療法に使用することはできませんので、しかし、このシステムは唯一のin vitro試験に用いることができる。このように、人工抗原提示細胞（AAPC）に依存して標準化されたシステムは、同種または異種のCEの落とし穴ずにDCの刺激効果を作り出すことができるLLS 12、13。ここで、我々はCD1dのベースAAPCを生成する方法を説明します。 CD1dの抗原複合体によるT細胞受容体（TCR）の係合は、NKT細胞の活性化、抗原の基本的な要件であるので：CD1dの-Igの複合体は、隔離し、アクティブ化、およびエフェクターNKT細胞集団を展開する信頼性の高い方法を提供します。
Protocol
1。 AAPCの世代
- ビーズにタンパク質を加える前に、すべての試薬 および緩衝液の準備：0.1M ホウ酸緩衝液を 、1X D-PBS（無のCa 2 +およびMg 2 +）、 ビーズ洗浄バッファー （1×PBS 5パーセントヒトAB血清+ 0.02％アジ化ナトリウム） ; 完全培地 （RPMI培地100 mMピルビン酸ナトリウム、10mMの非本質的なビタミン溶液、100mMのMEMビタミン溶液、1％2 -メルカプトエタノール、10μMシプロフロキサシン、5％ヒトAB血清）; MACSバッファー （1L PBS無料のCa 2 +およびMg 2 +、5グラムBSA、および2ミリモルのEDTA）。
- 5ミリリットル透明なホウケイ酸ガラスバイアル中で、スレッド3ミリリットル滅菌0.1Mホウ酸バッファー（ホウ酸と水、pH 7.0から7.4）で1ミリリットルのDynabeads M-450エポキシビーズを洗浄します。
- 1mlのPBS W / OのCa 2 +やMg 2 +別個1.5 mlマイクロチューブに、100μgのhCD1d-Igのダイマーおよび20μgの共刺激分子（抗CD28mAb例）を追加します。 <LI>プレースビーズビーズから磁石と吸引ホウ酸緩衝液にガラスバイアルを含む。ステップ1.2からガラスバイアルにタンパク質の混合物を追加し、キャップを交換してください。反転バイアルによって直ちに混和し、ローテーター上パラフィルム付のキャップ、そして場所をカバーし、4℃で一晩インキュベート
- 磁石の翌日、場所のガラスバイアルと慎重にビーズを回避しながら、タンパク質混合物を除去します。 3ミリリットルビーズ洗浄緩衝液（5％AB血清+0.02％アジ化ナトリウムを含むPBS）を添加し、4℃でインキュベートすることにより、ビーズを洗浄℃で5分間ローテーター上でC。二回繰り返します。
- ビーズはこのビーズ洗浄混合物中に保存することができます。 AAPC機能を作るために、少量を削除し、血球計算盤を用いてビーズを数える。タンパク質が安定した抗体（例えばPE結合抗マウスIgG1）で染色し、フローサイトメトリー分析を行うことにより、ビーズにロードされていることを確認してください。
- 抗原とビーズをロードするには、5×10 7ビーズを除去し、小1.5 mlのガラスバイアルに追加し、1 mlの滅菌PBSでビーズを洗浄してください。 Resuspendは1ミリリットル滅菌PBSでビーズを洗浄し、抗原を追加します。例：α-GalCer/KRN7000（5mg/ml）を使用したロード。 *注：私達は脂溶性またはミセル形成に問題を検出していませんが、脂質は、製造業者の推奨に従って処理する必要があります。具体的には、KRN7000は、これらの研究のためにDMSO（1mg/mlの）中で再構成されました。 KRN7000と他の糖脂質抗原はまた、0.2 mg / mlのPBS、0.5％Tween-20を（2時間超音波処理を行います。37℃）が含まれている中に溶解することができる。重要 - AAPCは、使用前に少なくとも48〜72時間のためにロードする必要があります。
2。 CD161 + CD3 +細胞の分離
- 末梢血単核球（PBMC）を収集します。軟膜またはleukopheresisパックからのリンパ球のフィコール密度勾配遠心分離のためには、まず室温で1×PBSと等量のヘパリン添加血液を薄める。
- フィコールの15ミリリットル（室温に暖め）を50mlコニカルチューブに追加します。ゆっくりオーバーレイフィコールの上に希釈血液混合物の25ミリリットル。 ブレーキをオフにして、室温で30分間2,000 rpmで遠心分離します。
- 慎重にパスツールピペットを用いてリンパ球インターフェース（メディアおよびFicoll間の白いリング）を削除し、新しい50 mlコニカルチューブに移す。
- PBSで50mlにチューブをいっぱいにし、5分間1,500 rpmで遠心分離して細胞を洗浄します。上清を捨てて、単一のチューブに一人の個人からチューブを組み合わせると20 mlのPBSで再び末梢血単核細胞（PBMC）を洗う。その後、PBMCをカウントし、MACSバッファー（Ca 2 +およびMg 2 +を 、5グラムBSA、および2ミリモルのEDTAを1リットルのPBS無料）で5×10 7細胞/ mlの濃度で再懸濁します。
- T細胞画分を単離するために、PBMC（10 8細胞）の2ミリリットルで開始し、EasySepヒトT細胞濃縮キットからパンT細胞の濃縮液100μlを添加する。室温で10分間インキュベートする。 さらに10分間室温で溶液とインキュベートする磁性粒子の100μlを添加する。 2.5〜溶剤mlの最終容積を持参し、5分間紫磁石にチューブを配置します。迅速15mlコニカルチューブにCD3 +画を捨て。
- 5mlの低温MACS緩衝液を加えて細胞を洗浄し、生細胞数をカウントし、FACS染色用のアリコートを削除します。
- 980μlの氷冷したMACSバッファーにCD161 +細胞は、最初の再懸濃縮T細胞を選択するには、10μgの抗CD161モノクローナル抗体を追加し、10分間冷蔵庫で静置します。
- 5分間、4℃で1,500 rpmで細胞を遠心分離します。その後MACSバッファー800μlの中で再構成する細胞ペレット。抗マウスIgG1マイクロビーズを200μl加え、4℃で10分間インキュベートするソリューション℃に
- このインキュベーションステップの間に、3ミリリットルのMACSバッファを追加することにより、LSカラムを平衡化します。
- 次に、5分間、4℃で1,500 rpmで遠心分離することにより細胞を洗浄する。 RESU3ミリリットルMACSバッファーで細胞を過ごす。その後、LSのMACS分離カラムに細胞を移します。ゆっくりピペッティングにより気泡が発生しないように確認してください。 MACS緩衝液3mlを添加することによりカラムを洗浄します。二回繰り返します。
- 3ミリリットル新鮮MACSバッファーを加え、磁石から列を削除する。 15 mlコニカルチューブに置き列。プランジャーを挿入して、精製されたCD161 + CD3 +細胞を得るために内容を押し出す。 NKT細胞濃縮画分をカウントします。あなたは2-4万個の細胞を持つ必要があります。
3。 AAPC媒介のNKT細胞の増殖
- 16ミリリットル完全培地（完全培地+ IL-2、100 U / ml）に10 6濃縮CD161 + CD3 + T細胞および10 6 AAPCを追加することにより、共培養をセットアップします。低蒸発蓋を96ウェル組織培養処理したポリスチレン、U底プレートに160μl/ウェル最終容量を追加することにより、プレートこの混合物を。新鮮な培地80μlを加えることによって、すべての7日目の培地交換を行います。
- 収穫細胞は、カウントされ、12から14日にFACS染色を行う。
- ステップ3.1で上記のように展開されたNKT細胞をプレーティングすることができ、特に16ミリリットル完全培地中で10 6拡張され、T細胞および10 6 AAPCを再懸濁します。 96ウェルU底プレートに160μl/ウェルを添加することによりプレートこの混合物を。新鮮な培地80μlを加えることによって、すべての7日目の共存培地を更新し続けています。
- それは拡張の第二ラウンド後に余分なNKT細胞を凍結するのが最善の方法です（1ミリリットル-5％DMSO / 95％FBS中で1×10 6 /クライオバイアル）。
4。機能テスト：NKT細胞のAAPC媒介刺激
- 5×10 4 NKT細胞をセットアップ/ 96ウェルU底プレートで200μlの最終容量（完全培地）中で5×10 5 AAPC持つ。
- 24〜48時間後にELISA用ハーベスト細胞培養上清。
Representative Results
ここに我々は、NKT細胞（ 図1）の増殖のための標準的な方法として、NKT細胞を刺激するために磁気ビーズにCD1dの-Igおよび抗CD28 mAbの共有結合によって作らCD1dの-IgをベースAAPCを生成する方法を説明します。まず、 1はCD1dの-Ig融合タンパク質を安定に磁気ビーズの表面に固定化されていることを示さなければなりません。 図2A、CD1dの-Igおよび抗CD28抗体に示す磁気ビーズの表面に発現していた両方。 AAPC、一晩培養上清を採取し、ELISA法により測定し、IL-2産生を有する我々は共培養NKT細胞ハイブリドーマ、AAPCの刺激能を調べることができます。我々は、CD1dの-IgをベースAAPCは、（ 図3、データは示されていない）に等しいか、またはそれらの細胞の対応よりも高いレベルでNKT細胞ハイブリドーマを刺激することができることがわかった。興味深いことに、我々はマウスのNKT細胞ハイブリドーマはヒトCD1dのベースAAPC（FIによって刺激されることがわかったAAPCの各バッチをテストするための簡単な方法を提供するグレ2B）。
次に、我々はAAPCの伝播可能性を実証しようとし、このようにヒトT細胞は、末梢血から単離した。最初のCD161 +、CD3 + T細胞画分を磁気ビーズ分離によって濃縮された。次に、T細胞は、α-GalCerを負荷されたAAPCと隔週刺激した。重要なことは、私たちも、比較的低い初期のNKT細胞集団（0.03％）で、我々は〜67パーセントVα24+Vβ11+（ 図3）細胞を拡大することができたことがわかった。我々は、多くの人の健康なボランティア及び癌患者のPBMCからNKT細胞を拡大しているとα-GalCerをロードしたAAPCは、両群でNKT細胞の人口を拡大することができたことを発見した。特筆すべきは、膨張率が非常にドナーに依存していました。期待どおりVα24+細胞の高い初期の人口は、膨張の大きな割合。加えて、+ CD3 + T細胞2×106細胞CD161の出発集団を使用しているとき、人は展開の2つのラウンド後に> 10 7個の細胞を（ 表1）を取得できます。拡張されたNKT細胞の約80〜90％がCD4 +であり、約5％のCD8 +、残りはおそらくCD4-CD8-ダブルネガティブのNKT細胞である。 図4A-Cに示すように、これらの拡張されたNKT細胞機能研究のために使用することができます。私たちは、ex vivoで拡大NKT細胞は、α-GalCerの刺激に対する応答性を維持し、IL-17Aの強力な生産者である、TNF-αおよびIFN-γ。ことを発見したそれは初期のT細胞濃縮人口が低く、1秒CD161濃縮ステップを実行することができない場合、AAPC媒介拡大が期待される結果を（ 図4D、ドナー1を参照）が得られないことに留意すべきである。循環するNKT細胞の割合が0.1％以上である場合は、1つはまだ大幅な拡大を得ることが可能であるべきです私は NKT細胞の。まとめると、これらのデータは、CD1dのベース - AAPCが効果的に展開し、初代ヒトNKT細胞を刺激するために使用することができることを実証している。
図1。 CD1dの模式図：IGベースAAPCS CD1dの分子の細胞外部分が短いアミノ酸リンカーにより分離免疫グロブリン重鎖タンパク質の定常領域に融合される。これらの分子は容易に単に興味のある脂質の過剰でそれらをインキュベートすることによって、例えば、α-トシルセラミドなどの脂質抗原をロードすることができます。 AAPCは、磁性ビーズにCD1dの-Igおよび抗CD Absを結合させることによって作られた。このシステムでは、CD1dの-Igは、TCRと抗CD28 mAbを介して同族の抗原特異的なシグナルを提供するために使用される共刺激シグナルを提供しています。
図2。 。のIgG二量体（PE結合抗マウスIgG1で染色経由）だけでなく、抗CD28抗体（FITC結合抗マウスIgG2aを使用）：AAPCS上の表面タンパク質のFACS染色 ）AAPCSはCD1dの存在について試験した。オープンヒストグラムはアイソタイプコントロールを示し、塗りつぶされたヒストグラムは、指示された抗体を表す。 CD1dの-Igを発現するAAPCは、NKT細胞によるIL-2産生を刺激することができます。 B）はVα14+マウスNKT細胞ハイブリドーマ、DN32.D3は、AAPCまたはα-GalCerを負荷されたAAPCを降ろし、中、可溶性抗原（α-トシルセラミド）のいずれかと共培養した。培養上清を採取し、標準のサンドイッチELISAは、IL-2産生を測定するために使用された。
図3。 CD1dの-Igをコーティングした人工抗原提示細胞によるNKT細胞の拡大。 （A）はプライマリCD3 + CD161 +二重陽性細胞は、磁気分離を用いてPBMCから単離した。選別された細胞は、α-GalCerをロードされ、14日間CD1dの-IgをコーティングしたAAPCで刺激した。細胞はVα24とVβ11以下AAPC刺激のために染色した。 （b）一次ヒトNKT細胞は、B細胞リンパ腫株の溶解を媒介する。抗原の存在下または非存在下、20〜24時間のために96ウェルU底プレート中-GalCerを（100 ng / ml）の中で示された比率でNKT細胞とともにインキュベートC1R-CD1dの細胞。 NKT細胞媒介細胞溶解は、標準の51Cr放出アッセイによりにより評価した。
図4。 AAPC展開されたNKT細胞のサイトカインプロファイル。 5 /ウェル）可溶性のα-GalCerと、PMA /イオノマイシン、anti-CD3/28ビーズ、またはα-GalCerをロードしたAAPCと共培養した（2×10 5 /ウェル）を48時間。 （A）は、IL-17A、（B）は、TNF-α、および（C）は、IFN-γ産生は、標準的なサイトカインをELISAで測定した。示されたデータは、ネガティブコントロール（メディアと空のビーズ）を差し引いた後の正味のサイトカイン産生しています。 （D）の一次T細胞は、磁気ビーズ分離を用いてPBMCから単離した。選別された細胞は、-GalCerをロードした-AAPC指示で2週間にわたって刺激した。細胞はVα24ための具体的な腹筋を用いて染色した+とVβ11+およびフローサイトメトリーによって分析した。
Discussion
AAPCは、NKT細胞の活性化のための基本的な要件を研究するために使用され、それは養子免疫療法のためのNK T細胞の ex vivo での拡張のための潜在的な臨床的価値を持つことができます。 Mescher らは、ビオチン化マウスMHCクラスI-ペプチド単鎖コンストラクトはラテックスミクロス14,15の表面にストレプトアビジンを介してビオチン化された共刺激分子B7.1およびB7.2と結合された第1ビードベースのシステムで、次のいずれかを記述した。このアプローチが成功したトランスジェニックマウスから抗原特異的T細胞を刺激するために使用されてきました。このアプローチは、MHC分子の均一な荷重を確実にするために、単鎖MHC-ペプチド複合体を使用しているので、さらに、それぞれの標的ペプチド抗原はこうしての一般性を制限することは、所望の一本鎖MHC-ペプチド複合体の発現のための新たなトランスフェクションを必要とするであろうアプローチ。重要なのは、博士シュネックのグループは、別の非細胞ビーズをベースAAPCを開発することによって、ビーズに基づく-AAPC先駆け、磁気ビーズにHLA-Igは、信号1、抗CD28、信号2を、結合させることによって行った。 HLA-Igは、免疫グロブリン分子足場16,17に融合されたHLAのユニークな多量体形態は、彼のグループによって開発されました。その後、彼らは効果的にCMVおよびMART-1特異的CTL 18を拡大することが示されているMHC-IgをベースAAPCを開発しました。ここでは、CD1dの-IgをベースAAPCは、機能的にNKT細胞を拡大するために使用することができることを実証した。ある研究では、CD1dの19とNK細胞の物理的相互作用を調べるために同様のシステムを使用しています。
特に、我々は最適なNKT細胞の増殖に必要な発見した要件に合わせることができます人工抗原提示細胞を設計しました。 AAPC展開法は、ヒトNKT細胞を拡大し、充実させるための、シンプルで信頼性の高い方法を提供します。当社AAPCは、体系的潜在的な共刺激分子のパネルの役割を評価するとNKT細胞prolifera上の自分の役割を評価するために変更することができますると機能。したがって、AAPCは、NKT細胞を誘導し、拡大するための有用な堅牢な汎用性の高い技術を表しています。 AAPCSの世代が1週間未満を取り、ビーズの大量生産に適しています。しかし、AAPCを生成するための重要なステップは、CD1dの-Igは安定したビーズの表面に固定化されていることを確認し、バッチ毎に一貫性を確保するため、その機能を評価することである。システムの潜在的な制限は、ビーズの機械的な除去以外に、刺激をオフにするために設けられているメカニズムがないことです。具体的には、抗原とT細胞受容体（TCR）の係：CD1d/MHC複合体は、一般的にT細胞の両方の阻害または抑制因子の誘導につながることができます付属品/接着分子とのコンサートにおける免疫シナプスを生成抗原が提示細胞。 AAPCシステムでは、これらの要因は、T細胞によってアップレギュレートされるかもしれませんが、ビーズは同族リガンドを発現していますこれらの受容体のために。
また、CD4 + NKT細胞がマウスとヒトでの抗腫瘍反応を抑制することが示されている、したがって、それはすべてのNKT細胞（α-GalCerを持つすなわちグローバル刺激）または間違ったサブセットの活性化の非選択的な活性化が不要な免疫学的につながる可能性があります成果。その結果、1は、表現型および機能的にAAPC膨張したNKT細胞集団を特徴づける必要があります。 図4に示すように、我々は、抗CD28を発現しているα-GalCerを負荷されたAAPCの刺激は、Th2 Th1細胞を産生するNKT細胞、とTh17型サイトカインをもたらすことができることを発見した。マウスの研究では、IL-33で挑戦することを報告している、最近同定されたサイトカインは、例えば、IL-5およびIL-13などの炎症性サイトカインの循環レベルの増加をもたらした。 IL-33とNKT細胞の治療は、それらのサイトカイン産生20を強化しました 。 IL-33はST2に特異的なリガンドであり、それは、可溶性ST2 CAが示されているnブロックのIL-33シグナル伝達。したがって、将来のアプリケーションの例として、AAPC表現するST2が生成され、NKT細胞によるTh1サイトカイン分泌を誘導する一方が選択的にTh2サイトカインの産生を抑制することができるかどうかを判断するために使用することができる。また、C57BL / 6マウスに発現しているKB-AAPCの静脈注射は、腫瘍21の減少、肺転移が生じていること。報告されている重要なことは、これらのデータは、肺にそのAAPCトラフィックを発揮し、エフェクターT細胞サブセットをアクティブにすることができます。したがって、1はAAPC複数のタイプを生成し、抗原特異的T細胞サブセットの間の相互作用を調べることができます。要約すると、これらの研究は、CD1dの-IgをベースAAPCは、正常な細胞APCを置き換えるために使用できることを実証し、NKT細胞ベース - 養子免疫療法のために現在の臨床的アプローチを強化するための潜在的に持っている。
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、有用な議論Priyankaスブラマニヤムに感謝したいと思います。著者らは金銭的利害が競合していない。この作品は、アメリカ癌協会は、NIH / NCI K01 CA131487、R21 CA162273、R21 CA162277、およびP30腫瘍免疫学およびTJウェッブへの免疫療法·プログラムからの補助金によって支えられている。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立癌研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17-1440 | |
| EasySep Human T Cell Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19051 | |
| Allophycocyanin CD161 human mAb | Pharmingen | 550968 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Anti-mouse IgG1 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-101 | |
| Dimer XI Recombinant Soluble Dimeric Mouse CD1d:IG Fusion Protein | BD Biosciences | 557599 | |
| Anti-CD28 mAb | Biolegend | 302914 | |
| M-450 Epoxy beads | Life Technologies | 150-11 | |
| Alpha-galactosylceramide (KRN7000) | Axxora, LLC | BML-SL232-0100 | |
| RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R 0883 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| Vitamin Solution | Gibco | 11120-052 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | ||
| Ciprofloxacin | Alexis Biochemicals | 380-288-G025 | |
| PE-Vα24Jα18 | Biolegend | 342904 | |
| PE-Vα24 (Clone C15) | Beckman Coulter | A66907 | |
| FITC-Vβ11 (Clone C21) | Beckman Coulter | A66905 | |
| PE-CD1d | Biolegend | 123510 | |
| PE anti mouse IgG1 | BD Biosciences | 556650 | |
| FITC anti-mouse IgG2a | Biolegend | 407105 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190250 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S8032 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440-00100 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | 431788 | |
| IL-2 (Proleukin) | BD Biosciences | 354043 | |
| Human AB Serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Labquake Tube Rotator | Fisher Scientific | 13-687-10Q | |
| BD Falcon 5 ml polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| Wheaton Glass Sample Vials with Cap | Fisher Scientific | Small (03-343-6A ) Large (03-343-6E) |
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