在这里,我们描述了一种方法激活和扩大人类NKT细胞的自体T细胞的人口使用人工抗原提呈细胞(AAPC)。 CD1D基于人工APC提供了使用功能的NKT细胞产生高的标准方法。
自然杀伤T(NKT)细胞是一种独特的子集T细胞,自然杀伤(NK)细胞和T细胞的特征性标记物显示。不同于传统的T细胞,NKT细胞识别脂质抗原CD1分子2的上下文中。 NKT细胞的表达一个不变的TCRα链重新排列:Vα14Jα18在小鼠和Vα24Jα18的在人类中,这是与有限的多样性的Vβ链3-6,以及被称为作为规范的或不变的NKT细胞(ⅰNKT细胞)。类似传统的T细胞,NKT细胞从CD4-CD8-胸腺前体T细胞发展CD1D 7适当的信令。利用NKT细胞,用于治疗目的的潜力已显着增加的能力,以刺激和扩大人类NKT细胞的α-半乳糖(α-神经酰胺),以及各种细胞因子8。更重要的是,这些细胞保留了原有的phenotypE,分泌细胞因子,并显示抗肿瘤细胞系的细胞毒性功能。因此, 体外扩增 NKT细胞保持功能和可用于过继性免疫治疗。然而,基于NKT细胞的免疫已限制使用自体的抗原呈递细胞和刺激细胞的数量和质量,这些基本上可以变化。已报道从癌症患者的单核细胞衍生的DC的共刺激分子的表达水平降低,并产生较少的炎性细胞因子9,10。事实上,已被用于小鼠DC而不是自体的APC从CML患者11 NKT细胞的功能进行测试。然而,这种系统只能被用于在体外测试,因为NKT细胞不能进行扩展,由小鼠DC,然后用于过继性免疫治疗。因此,标准化的系统依赖于人工抗原提呈细胞(AAPC)可能产生的刺激效果的DC没有的缺陷,异体或异种CELLS 12,13。在这里,我们描述了一种的方法产生CD1D基于人工APC。由于CD1D – 抗原复合物的T细胞受体(TCR)的参与是一个基本的要求,NKT细胞活化抗原:CD1D免疫球蛋白复合物提供了一种可靠的方法来隔离,激活和扩大效应NKT细胞群。
AAPC可以用来研究NKT细胞激活的基本要求和体外扩增的NK T细胞过继免疫治疗中具有潜在的临床价值。 mescher 等人描述的第一胎圈的系统,其中生物素化的小鼠MHC I类肽的单链结构,B7.1和B7.2通过链霉抗生物素蛋白与生物素化的共刺激分子结合的胶乳微球体14,15的表面。这种方法已被成功地使用从转基因小鼠的抗原特异性T细胞刺激。此外,由于此方法使用了一个单链,以确保均匀的负荷的MHC分子的MHC-肽复合物,每个目标肽抗原将需要一个新的表达所需的单链MHC-肽复合物的转染,从而限制的一般性的的方法。更重要的是,施内克博士的研究小组首创的珠基于人工APC,开发另一种非基于细胞珠的人工APC,由耦合到磁珠上的HLA-Ig的,信号1,和抗-CD28,信号2,。 HLA-Ig的,通过他的研究小组开发的一个独特的多聚体形式的免疫球蛋白分子的支架16,17的稠合的HLA。随后,他们开发的MHC-Ig的基于人工APC,这已被证明有效地扩大CMV和MART-1特异性CTL 18。在这里,我们已经证明,可用于扩展功能的NKT细胞CD1D-Ig的基于人工APC。一项研究使用了一个类似的系统来检查身体的NK细胞的相互作用与CD1D 19。
值得一提的是,我们设计了一个人工抗原呈递细胞,它是适用于任何的要求,我们找到所需的最佳NKT细胞的增殖。人工APC扩展方法提供了一种简单可靠的方法,扩大和丰富人类NKT细胞。我们的人工APC系统评估潜在的共刺激分子的面板的作用,并评估其对NKT细胞增殖的作用,可以修改TION和功能。因此,AAPC一个强大的通用技术,可用于诱导和扩大NKT细胞。 AAPCS需要的产生小于1周,适合用于生产大量珠。然而,生成人工APC的一个关键步骤是,以确认CD1D-Ig的被稳定地固定化的珠的表面上,并评估它们的功能,以确保从批次间的一致性。系统是有一定的局限性,没有一个机制,在关闭刺激,机械拆除的珠子以外的地方。具体而言,卡合的T细胞受体(TCR)与抗原:CD1d/MHC络合物通常生成的免疫突触在演唱会与配件/粘附分子,这可能会导致T细胞和诱导的抑制或抑制因素抗原呈递细胞。在的人工APC系统,这些因素都可能上调的T细胞,但珠不会表达的同源配体这些受体。
此外,CD4 + NKT细胞已显示出抑制在小鼠和人类的抗肿瘤反应,因此,它是可能的非选择性的活化NKT细胞的所有错误的子集( 即全球刺激与α-神经酰胺)或激活可以导致不想要的免疫学的结果。因此,一个人必须的表型和功能特征的的人工APC发泡NKT细胞种群。正如在图4中所示,我们已发现,表达抗-CD28刺激的α-神经酰胺加载人工APC可以导致NKT细胞产生Th1细胞,Th2细胞,和Th17型细胞因子。小鼠的研究报告说,挑战与IL-33,最近发现的细胞因子,导致循环炎性细胞因子,如IL-5和IL-13水平的提高。治疗的NKT细胞与IL-33增强细胞因子的产生20。 IL-33是ST2中,一个特定的配位体,它已被证明,可溶性ST2约n块IL-33信号。因此,作为将来的应用程序的一个例子,可以人工APC表达ST2产生和使用,以确定是否有一个可以选择性地抑制Th2型细胞因子的生产的,而诱导Th1细胞因子分泌的NKT细胞。也已报道,静脉注射KB-表示人工APC于C57BL / 6小鼠,导致减少的肺转移的肿瘤21。更重要的是,这些数据表明,人工APC交通肺和能够激活效应T细胞亚群。因此,可以生成多种类型的人工APC和检查抗原特异性T细胞亚群之间的相互作用。总之,这些研究表明,CD1D-Ig的基于人工APC可以用来取代正常细胞的APC,和具有的潜力,以提高基于NKT细胞的过继性免疫治疗的目前的临床途径。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢普里Subrahmanyam的有益讨论。作者没有竞争的经济利益。支持这项工作是由美国癌症协会,NIH / NCI K01的CA131487,R21 CA162273 R21 CA162277,和P30肿瘤免疫学和免疫计划,以TJ韦伯的补助。的内容完全是作者的责任,并不一定代表官方意见,国家癌症研究所,美国国立卫生研究院。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17-1440 | |
EasySep Human T Cell Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19051 | |
Allophycocyanin CD161 human mAb | Pharmingen | 550968 | |
EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
Anti-mouse IgG1 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-101 | |
Dimer XI Recombinant Soluble Dimeric Mouse CD1d:IG Fusion Protein | BD Biosciences | 557599 | |
Anti-CD28 mAb | Biolegend | 302914 | |
M-450 Epoxy beads | Life Technologies | 150-11 | |
Alpha-galactosylceramide (KRN7000) | Axxora, LLC | BML-SL232-0100 | |
RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R 0883 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Vitamin Solution | Gibco | 11120-052 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | ||
Ciprofloxacin | Alexis Biochemicals | 380-288-G025 | |
PE-Vα24Jα18 | Biolegend | 342904 | |
PE-Vα24 (Clone C15) | Beckman Coulter | A66907 | |
FITC-Vβ11 (Clone C21) | Beckman Coulter | A66905 | |
PE-CD1d | Biolegend | 123510 | |
PE anti mouse IgG1 | BD Biosciences | 556650 | |
FITC anti-mouse IgG2a | Biolegend | 407105 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190250 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S8032 | |
Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440-00100 | |
EDTA | Sigma Aldrich | 431788 | |
IL-2 (Proleukin) | BD Biosciences | 354043 | |
Human AB Serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
Labquake Tube Rotator | Fisher Scientific | 13-687-10Q | |
BD Falcon 5 ml polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
Wheaton Glass Sample Vials with Cap | Fisher Scientific | Small (03-343-6A ) Large (03-343-6E) |