Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

مشهي التعلم النقابي في الشم doi: 10.3791/4334 Published: February 18, 2013

Summary

ذبابة الفاكهة اليرقات قادرة على ربط المحفزات الرائحة مع مكافأة الذوقية. نحن هنا وصف لنموذج بسيط السلوكية التي تسمح للتحليل التعلم مشهي حاسة الشم النقابي.

Abstract

في ما يلي نحن تصف تفاصيل المنهجية للتعلم مشهي حاسة الشم النقابي في يرقات ذبابة الفاكهة. الإعداد، إلى جانب التدخل الجيني، ويوفر مؤشر إلى تحليل الأسس العصبية والجزيئية للتعلم النقابي على وجه التحديد في مخ اليرقات بسيطة.

يمكن استخدام الكائنات التجارب السابقة لضبط السلوك الحالي. ويمكن تعريف اكتساب مثل هذه الإمكانات السلوكية والتعلم، و. الأسس المادية لهذه الإمكانيات وآثار الذاكرة 1-4 علماء الأعصاب في محاولة لفهم كيفية تنظيم هذه العمليات من حيث التغيرات الجزيئية والخلايا العصبية في الدماغ باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب في الكائنات النموذج تتراوح بين 5،6 الفقاريات الحشرات ل. لهذه المساعي من المفيد استخدام نظم نموذجية التي هي بسيطة ويمكن الوصول إليها تجريبيا. تحول اليرقة إلى ذبابة الفاكهة لتلبية هذه المطالب على أساستوفر فحوصات السلوكية قوية، وجود مجموعة متنوعة من التقنيات المعدلة وراثيا ومنظمة الابتدائية للجهاز العصبي يتألف من حوالي 10000 فقط الخلايا العصبية (ولو مع بعض التنازلات: القيود المعرفية، السلوكية خيارات قليلة، وثراء تجربة مشكوك) 7-10 .

ذبابة الفاكهة يمكن أن اليرقات بين الروائح تكوين الجمعيات وتعزيز ذوقي مشهي مثل السكر 11-14. في مقايسة القياسية، التي أنشئت في المختبر من جربر B.، الحيوانات تلقي اثنين رائحة متبادلة التدريب: يتعرض A المجموعة الأولى من اليرقات لرائحة A إلى جانب معزز الذوقية (مكافأة السكر) ويتعرض بعد ذلك إلى رائحة B دون تعزيز 9. وفي الوقت نفسه مجموعة ثانية من اليرقات يتلقى التدريب المتبادل في الوقت الذي تشهد رائحة A دون تعزيز وبالتالي التعرض لرائحة B مع تعزيز (مكافأة السكر). في ما يلي كلا المجموعتين هي قسم التدريب والامتحاناتتيد لتفضيلها بين الروائح اثنين. تفضيلات أعلى نسبيا لتعكس رائحة مكافأة التعلم النقابي - كما عرضت مؤشر الأداء (PI). اختتام فيما يتعلق بطبيعة النقابي للمؤشر أداء مقنعة، لأن ما عدا الطوارئ بين الروائح وtastants، غيرها من المعالم، مثل رائحة والتعرض مكافأة، ومرور الزمن لا تختلف معالجة بين المجموعتين 9.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد

  1. تثار ذبابة الفاكهة البرية من نوع اليرقات عند 25 ° C و 60٪ -80٪ الرطوبة في دورة 14/10 الضوء / الظلام. للتحكم في السن المحدد لليرقات دائما يتم وضع 20 إناث 10 ذكور مع واحد فيال (6 سم الارتفاع و 2.5 سم القطر) التي تضم حوالي 6 مل من الغذاء يطير القياسية. ويسمح الذباب لتضع بيضها لمدة 12 ساعة ويتم نقلها إلى قارورة جديدة في اليوم الثاني. 5-6 أيام بعد وضع البيض يرقات الوصول إلى التغذية المرحلة 3 الطور الثالث وإذا أثيرت في C ° 25، ويمكن أن تستخدم الآن للتجربة السلوكية. ومع ذلك، يتعين على المرء أن تكفل لليرقات فقط تأخذ التي لا تزال في الطعام وليس اليرقات من جانب القارورة. وقد وصلت هذه اليرقات بالفعل "يتجول 3 ش الطور مرحلة" - قبل فترة وجيزة التشرنق - واستخدامها يعقد تفسير النتائج.
  2. إعداد أطباق بتري 2.5٪ الاغاروز (مختبرات أخرى أيضا استخدام تركيزات أجار من 1٪ في كافة مراحل التجربة، وكيفتركيزات أقل من أي وقت مضى قد تسمح للتغذية يرقات العمر الثالث 3 إلى حفر في طبقة سفلية): حل 2.5 غرام في 100 مل الاغاروز O. 2 DDH تسخين الحل في الميكروويف حتى يبدأ الغليان. تستنهض الهمم بعناية الحل ووضعها مرة أخرى في الميكروويف حتى يذوب جميع الاغاروز. من أجل حل الاغاروز الساخنة في أطباق بتري بحيث يتم تغطيتها بالكامل الجزء السفلي من أطباق بتري والحل الاغاروز يشكل سطح أملس. السماح للحل يبرد إلى درجة حرارة الغرفة وأغلق الأغطية. لا تغلق فورا الأغطية، لأنه يتيح التكثيف من الماء في الأغطية.
  3. إعداد أطباق بتري 2M الفركتوز: حل 2.5 غرام في 100 مل الاغاروز O 2 DDH (مرة أخرى، واستخدام تركيز 1٪ أجار ممكن، إلا أنه قد يسمح تغذية يرقات العمر الثالث 3 إلى حفر في طبقة سفلية). تسخين الحل في الميكروويف حتى يبدأ الغليان. تستنهض الهمم بعناية الحل ووضعها مرة أخرى في الدقيقةحتى يذوب موجة جميع الاغاروز. إضافة 35 غ بعناية من الفركتوز في حل الساخنة؛ تستنهض الهمم الخليط ببطء حتى يذوب السكر لتجنب التخلف الغليان. صب الساخنة الفركتوز الاغاروز حل في أطباق بتري بحيث يتم تغطيتها بالكامل أسفل والحل الفركتوز الاغاروز يشكل سطح أملس. السماح للحل يبرد إلى درجة حرارة الغرفة وأغلق الأغطية. لا تغلق فورا الأغطية، لأنه يتيح التكثيف من الماء في الأغطية.
  4. إعداد 1-الأوكتانول الحاويات رائحة (OCT): تعبئة 10 ميكرولتر من أكتوبر النقي إلى العرف تفلون حاوية رائحة وإغلاقه مع غطاء يحتوي على العديد من الثقوب الصغيرة للسماح للتبخر الرائحة. ويرد وصف تفصيلي للحاويات في جربر وستوكر عام 2007. إعداد الحاويات الثلاثة لرائحة أكتوبر حاويات رائحة تسمح لتبخر المواد الكيميائية المدرجة، ولكن تجنب أن اليرقات يمكن الاتصال بهم مباشرة. وهكذا، فإن التجارب الموصوفة هنا على وجه التحديدحاسة الشم في معالجة التعلم اليرقات دون تكدير الآثار الجانبية الذوقية.
  5. إعداد الحاويات amylacetate رائحة (AM): تمييع AM 1:50 في زيت البارافين. ملء 10 ميكرولتر من التخفيف في العرف الحاويات رائحة تفلون وإغلاقه مع غطاء يحتوي على العديد من الثقوب الصغيرة للسماح للتبخر الرائحة. إعداد الحاويات الثلاثة لرائحة AM. التخفيف من المهم لأسباب عملية، وهي لتجنب تفضيل قوي لمدة الرائحة فوق الأخرى التي قد تخفي تغيير التعلم التي تعتمد على تفضيل في النسبية بين الروائح اثنين. قد جذب متساوية لكلا الروائح تحتاج إلى تأكيد في المختبر قبل التجربة من خلال تطبيق الاختبار وصفها لاحقا (2.5) مع الحيوانات السذاجة. القيم تستند المقدمة هنا على عدة منشورات من المختبر جربر التي تم استنساخها مؤخرا من قبل المختبر 9،15،16.
  6. وضع العلامات من أطباق بتري: قبل التجارب السلوكية جميع أطباق بتري ينبغي أن تكون مشفرة. وهذا يعني أنسكر الفواكه التي تحتوي على أطباق بتري أن تكون وضعت على سبيل المثال مع "X" أو "A" والاغاروز فقط أطباق بتري مع "Y" أو "B". وينبغي كشف هذا الرمز إلى المجرب إلا بعد تسجيل جميع البيانات. عن طريق إجراء التجارب "أعمى" لذلك ليس من الممكن أن توقعات المجرب يمكن أن تؤثر على أداء اليرقات. لتخفيف فهم لقراء واسعة في ما يلي سوف نتحدث فقط عن الروائح والمحفزات مكيفة (CS1 أو CS2) التي تتم مكافأة إما عند تقديمها على طبق بتري الفركتوز (+) أو غير مكافأة، وعندما عرضت على الاغاروز فقط طبق بتري (-).

2. السكر والتدريب مكافأة اختبار

  1. جمع 30 تغذية يرقات العمر الثالث 3 من قارورة الغذاء. نقلها إلى طبق بتري الأولى التي تحتوي على بعض قطرات من ماء الصنبور والانتقال بعناية الأمام وإلى الوراء باستخدام فرشاة. نقلها إلى طبق بتري الثاني الذي يحتوي أيضا على بعض قطرات من الصنبور واثالثا للتأكد من أن أي معجون الطعام يبقى على bodywall من اليرقات؛ اليرقات وإلا سيكون قادرا على تجربة رائحة الطعام أثناء التجربة. هذا من شأنه أن يحجب المرجح عملية التعلم والأداء في حالة الاختبار.
  2. يتم تطبيقها على تدريب المنتسبين اليرقات إلى الروائح مع جديلة السكر مشهي النظام التالية: التدريب. وضع وعاء رائحة أكتوبر على الجانب الأيمن والأيسر من "X" تميز - وهكذا، تحتوي على سكر الفواكه مكافأة (+) طبق بتري ("العمياء" التجربة، لمزيد من التفاصيل انظر 1.6). وضع مجموعة من 30 3 التغذية يرقات العمر الثالث على وسط طبق بتري، أغلق الغطاء والانتظار لمدة 5 دقائق في حين يتعرض لها الحيوانات إلى أكتوبر تأكد من أن لا يتم محاصرين داخل اليرقات قطرة الماء، ويمكن التغلب على التوتر السطحي منه. يمكن أن اليرقات من التحرك بحرية على طبق بتري وتجربة المحفزات حاسة الشم و / أو الذوقية.
  3. التدريب: إزالة اليرقات من طبق بتري مع فرشاة مبللة ونقلم على طبق بتري الثانية التي وصفت ب "Y" - وهكذا، الاغاروز فقط (-) التي تحتوي على طبق بتري - ولها رائحة وعاء AM يقع على جانبها الأيسر والأيمن. إغلاق الغطاء وانتظر لمدة 5 دقائق في حين يتعرض لها الحيوانات لAM.
  4. التدريب: كرر 2.2) و 2.3) مرتين، مثل أن جميع اليرقات خبرة 30 دورة تدريبية لمدة ثلاثة: CS1 / (+) - CS2 / (-)؛ CS1 / (+) - CS2 / (-)؛ CS1 / (+) - CS2 / (-). في هذه التجربة تمثل CS1 أكتوبر ورموز CS2 لAM.
  5. اختبار: واحدة مكان وAM حاوية واحدة رائحة أكتوبر على مواقع معارضة لطبق بتري الاغاروز فقط. نقل الحيوانات المدربة إلى منتصف الاختبار طبق بتري. إغلاق الغطاء وانتظر لمدة 5 دقائق. عد في وقت لاحق عدد من اليرقات على الجانب الأيسر، الجانب الأيمن من وسط والاختبار طبق بتري.
  6. كرر الخطوات 2.1) إلى 2.5) مع مجموعة ثانية من 30 3 التغذية يرقات العمر الثالث ولكن مبادلة الأدوار التجريبية من وأكت AM بحيث تظهر الحيوانات التدريبية التالية: CS2/ (+) - CS1 / (-)؛ CS2 / (+) - CS1 / (-)؛ CS2 / (+) - CS1 / (-). في هذه التجربة تمثل CS1 أكتوبر ورموز CS2 لAM.
  7. احتمال وجود ترتيبات للتدريب. أعلاه نقدم للتدريب موجود المحاكمات تدريبية لمدة ثلاثة إما من أكتوبر / (+) - AM / (-) أو في مجموعة من التجارب المتبادلة أيضا تدريب ثلاثة من / AM (+) - اكتوبر / (-). ومع ذلك لتجنب الآثار تعتمد تسلسل أثناء التدريب من المهم أن تختلف تسلسل المحفزات في التكرار التالي من التجربة كاملة. من خلال تغيير النظام CS1 أو CS2 وكذلك تقديم مكافأة في لوحة الأول أو الثاني قدم وأربعة سلاسل مختلفة للمحاكمات التدريب ممكنة:
أول مجموعة CS1 / (+) - CS2 / (-) مجموعة المتبادلة CS2 / (+) - CS1 / (-)
CS1 / (-) - CS2 / (+) CS2 / (-) - CS1 / (+)
CS2 / (+) - CS2 / (-) CS1 / (+) - CS2 / (-)
CS2 / (-) - CS1 / (+) CS1 / (-) - CS2 / (+)

لمنع الآثار المنهجي للمحفزات في البيئة المحيطة التجريبية، ينبغي للمرء أن إجراء اختبار في نصف واحد من مثل هذه الحالات التي يتم تقديم أكتوبر على اليسار وإلى اليمين AM. في النصف الآخر من الحالات يجب أن تعرض AM على اليسار وأكت على اليمين.

3. اختبارات كليات الحسية والحركية المهام ذات الصلة

تصميم التجارب الموصوفة أعلاه يسمح لتحليل رائحة السكر التعلم في نوع البرية تغذية يرقات العمر الثالث 3 من تلقاء نفسها. ومع ذلك، في الحياة اليومية الباحثين المختبر وعادة ما يستخدم اثنين أو أكثر من المجموعات التجريبية مختلفة من اليرقات لمقارنة، إذا تعلم الشمية يعتمد على قدم المساواةوأضاف جين ticular، مجموعة محددة من الخلايا العصبية، مخزون متحولة، والحمية الغذائية الخاصة، وظروف تربية مختلفة، المواد الكيميائية السامة خلال التنمية، الخ وهكذا، في جميع الحالات عندما يتم اختبار اثنين أو أكثر من المجموعات التجريبية من اليرقات على المرء أن تفعل مجموعة من التجارب لاختبار السيطرة إلزامية، إذا كانت مجموعات مختلفة من اليرقات تظهر السليم البراعة الحسية والحركية. هذا يصبح إلزاميا والظواهر المحتملة ليست بالضرورة نتيجة لانخفاض القدرات أو إلغاؤها إلى الروائح المنتسبين مع السكر. بل يمكن بناء إمكانات التعلم على العيوب العيوب في أي خطوة من الدوائر الحسية والحركية في معالجة الروائح و / أو السكر. أو بعبارة أخرى، إذا كان يرقة متحولة غير قادر على الشعور السكر، فإنه لا يمكن إنشاء ذاكرة السكر. ولكن هذا لا يسمح الختامية التي اليرقة لا تعلم. بالتفصيل التجارب التحكم التالية التي ينبغي القيام به لاختبار المناسب AM، OCT والفركتوز تجهيز يرقات المعدلة وراثيا.

1. اختبار لprefe أكتوبر السذاجةrence

جمع 30 تغذية يرقات العمر الثالث 3 من قارورة الغذاء. غسلها بعناية في مياه الحنفية كما هو موضح في 2.1. وضع رائحة أكتوبر احدة الحاويات على جانب واحد من طبق بيتري الاغاروز، إضافة إلى يرقات منتصف طبق بتري، أغلق الغطاء والانتظار لمدة 5 دقائق، بحيث يمكن لليرقات أن الزحف على طبق بتري وتوجيه نحو أكتوبر رائحة المصدر. عد في وقت لاحق عدد من اليرقات على الجانب الأيسر، في الوسط، وعلى الجانب الأيمن من الاختبار طبق بتري.

2. اختبار لتفضيل AM السذاجة

جمع 30 تغذية يرقات العمر الثالث 3 من قارورة الغذاء. غسلها بعناية في مياه الحنفية كما هو موضح في 2.1. وضع واحد حاوية رائحة صباحا على جانب واحد من طبق بيتري الاغاروز، إضافة إلى يرقات منتصف طبق بتري، أغلق الغطاء والانتظار لمدة 5 دقائق، بحيث يمكن لليرقات أن الزحف على طبق بتري وتوجيه نحو AM رائحة المصدر. بعد ذلك عد عدد Larvae على الجانب الأيسر، في الوسط، وعلى الجانب الأيمن من الاختبار طبق بتري.

3. اختبار لتفضيل السكر السذاجة

جمع 30 تغذية يرقات العمر الثالث 3 من قارورة الغذاء. غسلها بعناية في مياه الحنفية كما هو موضح في 2.1. إعداد أطباق بتري التي تحتوي على الاغاروز 2.5٪ في نصف سكر الفواكه و2M-الاغاروز الخليط في النصف الآخر. إضافة اليرقات على طبق بتري، أغلق الغطاء والانتظار لمدة 5 دقائق، بحيث يمكن لليرقات أن الزحف على طبق بتري وتوجيه نحو الجانب الفركتوز تحتوي على. عد في وقت لاحق عدد من اليرقات على الجانب الأيسر، في الوسط، وعلى الجانب الأيمن من الاختبار طبق بتري.

إعداد أطباق بتري نصف النصف: إعداد لوحات طبيعية الاغاروز كما هو موضح أعلاه في القسم 1.2. عندما يتم تبريد ملء الاغاروز أطباق بتري أسفل، وقطع بعناية الاغاروز على طول المحور العمودي مع مشرط. إزالة نصف الاغاروز من طبق بيتري. Aي ي ساخنة الفركتوز الاغاروز حل (انظر لإعداد 1.3) إلى النصف الفارغ من طبق بيتري. كن حذرا بأن كل شطر مباراة ولا تشكل ميزة محددة - وهذا يؤثر على سلوك خيار اليرقات ويجعل من الصعب على التحليل السلوكي بدلا 4.

التدريب الشام

على الرغم من التجارب المعدلة وراثيا إذا تغذية يرقات العمر الثالث 3 قادرون على تمييز على مستوى النوع البري بين أكتوبر والهواء (3.1)، وAM الهواء (3.2) والسكر ونقية الاغاروز (3.3)، مجموعة إضافية من التجارب اختبار في الآونة الأخيرة عرض (للمناقشة رؤية وجربر ستوكر، 2007). الأساس المنطقي لهذه التجارب هو ما يلي. اليرقات خلال التدريب الخضوع معالجة واسعة النطاق ورائحة المتعاقبة والسكر التحفيز. وبالتالي، فمن الممكن تماما أن النمط الظاهري مضلل التعلم الملاحظة (على الرغم من رائحة السذاجة تصور واختبارات السكر على مستوى نوع البرية!). في الواقع، فمن الممكن أن الحيوانات المعدلة وراثيا دiffer من يرقات النوع البري فيما يتعلق مقاومة الإجهاد، والدافع، والتعب، والتكيف الحسي والتعلم السياقية، والتغيرات في الشبع. وهكذا، قدم ميشيل وآخرون (2005) أن ضوابط اختبار ما إذا كان متحولة قادرة على إعطاء (1) كشف AM مقابل وعاء فارغ رائحة إذا كنت علاج اليرقات تماما كما أثناء التدريب إلا أن قمت بحذف الثواب وفضح كل من مجرد الروائح، (2) كشف أكتوبر بعد نفس النظام، (3) مقابل الكشف عن وعاء AM رائحة فارغة، إذا كنت علاج اليرقات بطريقة تشبه التدريب إلا أن قمت بحذف الروائح وفضح لمجرد المكافأة، و (4 ) كشف أكتوبر بعد نظام نفسه. للاطلاع على مناقشة شاملة ومزيد من التفاصيل حول طرق الرجاء راجع ميشيل وآخرون (2005) وجربر وستوكر (2007).

4. تحليل البيانات للتعلم مكافأة السكر

  1. لتقييم بيانات من التعلم بروتوكول السكر مكافأة حساب مؤشر تفضيل أكتوبر (PREF OCT) لكل من recipro 2تدريب مجموعات أتوماتيكيا:
    للمجموعة الأولى التي حصلت أكتوبر / (+) - AM / (-) التدريب:
    PREF أكتوبر (OCT + /-AM) = (عدد اليرقات على الجانب أكتوبر - عدد اليرقات على الجانب AM) / # جميع اليرقات داخل المناطق اليسار واليمين والوسط
    للمجموعة الثانية التي تلقت / AM (+) - اكتوبر / (-) التدريب:
    PREF AM (AM + / OCT-) = (عدد اليرقات على الجانب AM - عدد اليرقات على الجانب OCT) / # جميع اليرقات داخل المناطق اليسار واليمين والوسط
  1. حساب مؤشر الأداء (PI) لاثنين من القيم PREF 4.1). ويمثل التعلم PI النقابي من قبل تلغي نتائج مشوشة من رائحة والتعرض العقاب، مرور الوقت والتعامل مع المواد:
    PI = (PREF أكتوبر (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / أكتوبر)) / 2
    وبالتالي يمكن أن تتراوح من حزب القانون والعدالة -1 إلى 1. القيم السلبية بشكل كبير تمثل التعلم مكره، في حين القيم الإيجابية بشكل ملحوظ وصف التعلم مشهي. تجربة كاملة تضم عادة 10 أو أكثر من حزب القانون والعدالة. تصور البيانات ومنها: قطع مربعز جميع القيم إلى مجموعة تجريبية معينة. كونها تقع 50٪ من القيم داخل مربع؛ يشار مؤشر أداء متوسط ​​كخط جريئة ضمن مؤامرة مربع.

5. تحليل البيانات للكليات الحسية والحركية المهام ذات الصلة

  1. لتقييم بيانات عند اختبار لمعالجة رائحة السليم أكتوبر حساب تفضيل رائحة أكتوبر المؤشر على النحو التالي:
    رائحة PREF أكتوبر = (عدد اليرقات على الجانب أكتوبر - عدد اليرقات على الجانب الآخر) / عدد جميع اليرقات داخل المناطق اليسار واليمين والوسط
  2. لتقييم بيانات عند اختبار لإدراك السليم رائحة AM حساب تفضيل رائحة AM مؤشر على النحو التالي:
    رائحة PREF AM = (عدد اليرقات على الجانب AM - عدد اليرقات على الجانب الآخر) / عدد جميع اليرقات داخل المناطق اليسار واليمين والوسط
  3. لتقييم بيانات التصور عند اختبار لسكر الفواكه المناسبة حساب مؤشر تفضيل الفركتوز على النحو التالي:
    PREF الفركتوز = (عدد اليرقات على الجانب الفركتوز - عدد اليرقات على الجانب الآخر) / عدد جميع اليرقات داخل المناطق اليسار واليمين والوسط
  4. وترد تفاصيل لتدريب الشام في ميشيل وآخرون 2005.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الرقم 1A يبين لمحة عامة عن الإجراءات التجريبية للتعلم اليرقات النقابي حاسة الشم. من الاقتران واحدة من الروائح المطروحين مع السكر اليرقات مكافأة السلوك اكتساب القدرة على إبداء استجابة جذابة نحو رائحة مكافأة بالمقارنة مع رائحة خائبة. ويتم تدريب دائما مجموعتين من اليرقات الاقتران إما معزز مع رائحة أو أكتوبر AM. مؤشر الأداء (PI) يقيس وظيفة النقابي على أساس الفرق في التفضيل بين مجموعات مدربة بشكل متبادل.

في حالة ويتم تحليل وظيفة النقابي في يرقات المعدلة وراثيا، ويلزم لاختبارات القدرة الحسية والحركية الأساسية. يتم ذلك من خلال منحهم حرية الاختيار بين وعاء ورائحة تملأ الهواء النقي أو بين الاغاروز والاغاروز بالإضافة إلى السكر. (لا يظهر هنا الشام التدريب). ويلاحظ توزيع النهائي لليرقات في ورقة بيانات محددة (الشكل 2) وفيماكما ualized مؤامرة مربع (الشكل 3). نتائج إيجابية تشير إلى السلوك خيارا جذابا للمؤشرات تفضيل مشهي والتعلم في حالة مؤشرات الأداء. القيم السلبية تشير إلى سلوك خيار مكره لمؤشرات تفضيل حساب والتعلم مكره في حالة مؤشرات الأداء.

الشكل 1
الشكل 1. خطة من التجارب السلوكية لقياس اليرقات التعلم النقابي حاسة الشم، والأفضليات حاسة الشم السذاجة والتفضيلات الذوقية السذاجة.

  1. يتم وضع 30 ذبابة الفاكهة التغذية 3 يرقات العمر الثالث لمدة خمس دقائق على طبق بتري تحتوي على الاغاروز مكافأة من السكر سكر الفواكه 2M. في نفس الوقت يتم توفير رائحة الأولى في الحاوية تفلونق (OCT). وبالتالي يمكن ربط اليرقات حافزا رائحة مع معزز إيجابي في مرحلة التدريب الأولى. يتم نقل المقبلة، اليرقات إلى طبق بتري 2 الاغاروز دون معزز ولكن مع رائحة الثاني (AM) لل5 دقائق مرة أخرى. يتم تكرار التدريب ثلاث مرات. وأخيرا، في حالة اختبار يقاس تفضيل رائحة اليرقات لرائحة مكافأة ضد رائحة غير مكافأة على طبق بتري الاغاروز. هذا يسمح حساب مؤشر الأفضلية الأولى (PREF). يتم تدريب المجموعة الثانية من اليرقات وبالمثل بطريقة متبادلة. هنا، يمكن حساب مؤشر الأفضلية الثانية (PREF). وأخيرا يتم حساب مؤشر الأداء (PI) عن طريق حساب متوسط ​​الأرقام القياسية لتفضيل على حد سواء. لمزيد من المعلومات بشأن سلسلة من التجارب انظر أيضا 2.7.
  2. لتحليل تفضيل رائحة السذاجة، يتم وضع وعاء واحد رائحة مليئة إما أكتوبر أو صباح يوم جانب واحد من الطبق نقية بيتري الاغاروز. 30 تغذية يرقات العمر الثالث 3 هي جيش التحرير الشعبى الصينىدائرة الهندسة المدنية في منتصف طبق بتري وبعد 5 دقائق يتم حساب توزيع اليرقات على طبق بيتري. من البيانات التي تم الحصول عليها ثم يتم حساب مؤشر تفضيل حاسة الشم (PREF).
  3. لتحليل ساذج 2M تفضيل ذوقي الفركتوز يتم تعبئة في نصف طبق بتري يحتوي على نقية الاغاروز على جانبها الآخر. يتم وضع التغذية 30 3 يرقات العمر الثالث في منتصف طبق بتري وبعد 5 دقائق يتم حساب توزيع اليرقات على طبق بيتري. من البيانات التي تم الحصول عليها ثم يتم حساب مؤشر ميول الذوقية (PREF).

الشكل 2
الشكل 2. مثال على ورقة البيانات الخام لتسجيل ومعالجة البيانات التي تم الحصول عليها لA التعلم السكر مكافأة)، B) السذاجةتفضيلات ورائحة C) تفضيلات ذوقي السذاجة. لجميع التجارب وأشار عدد من اليرقات على الجانب الأيسر، في الوسط، وعلى الجانب الأيمن من أطباق بتري. للخروج من هذه المؤشرات تفضيل المعلومات (PREF) وتحسب. ويصور التعلم اليرقات ومؤشرات الأداء (PI) المستمدة من computating للبادئات من مجموعتين بالتبادل تدريب. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3
الشكل 3. تصور البيانات التي تم الحصول عليها مثال لA التعلم السكر مكافأة)، B) تفضيلات رائحة السذاجة وC) تفضيلات ذوقي السذاجة. Boxplots تمثيل البيانات على النحو التالي: الوسيط ( خط جريئة ضمن مربع)، ويشير إلى مربع 50٪ من جميع نقاط البيانات في حين أن الخط الطولي العلوي والسفلي يمثل 25٪ لكل منهما الأخرى. ولذلك القيم المتطرفة دون يشار إلى القيم الدنيا والقصوى من حدود الخط الطولي. كما وصفت القيم المتطرفة دوائر صغيرة وتعرف على أنها أي لحظة أكثر من 1.5 أضعاف المدى الربيعي من 1st و الشرائح الربعية 3. ويتم التحليل الإحصائي للبيانات واحدة مع نقطة الاختبار وقع رتبة يلكوكسون، في حين يتم استخدام اختبار يلكوكسون مبلغ رتبة للمقارنة بين مجموعات البيانات اثنين. يشار إلى مستويات الدلالة كما NS لP> 0.05، ل* P <0.05 **، لف <0.01 *** أو لP <0.001. حجم العينة من كل تجربة: N = 15.

لتجارب التعلم في A) دائما تؤخذ مؤشرات تفضيل اثنين (PREF) من التجارب المتبادلة لحساب مؤشر الأداء النهائي (PI). وصفت أداء مؤشرات الأسهم الأمريكية (PI) والمؤامرات مربع وفقا لذلك.

= "دائما"> الشكل 4
الشكل 4. أمثلة على كل من خطوط GAL4 التي تصف مجموعة محددة من الخلايا في الدماغ اليرقات. وتظهر دائما كاملة Z-الإسقاطات وجهات النظر الجبهي من الدماغ اليرقات. وصفت مجموعات محددة من الخلايا العصبية المضادة للبروتين فلوري أخضر (الأخضر) في الجهاز العصبي المركزي واليرقات كله ان تصور من قبل doublestaining anti-FasII/anti-ChAT (قرمزي). A) NP225 التسميات مجموعة من الخلايا العصبية الشمية الدرجة الثانية، ودعا الإسقاط ودعا الخلايا العصبية (السهم) ونظام أخلاقي النامية البصرية (رأس السهم). B) NP2426 علامات مجموعة من interneurons حاسة الشم (السهم) في محطة ترحيل حاسة الشم أولا، الفص antennal. C) GR66a تصف حصريا مجموعة من الخلايا العصبية الحسية الذوقية التي المشروع من الأجهزة الطرفية الحسية الذوقية إلى العقدة subeosophageal (سهم). D) NP3128 تسميات عدة مجموعات من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية. السهم يمثل interneurons من الفص الشمي antennal باء مماثل لرأس السهم يسلط الضوء على مجموعة من الخلايا العصبية الدوبامين هذا المشروع على منطقة تسمى هيئة neuropil الفطر. E) H24 علامات مجموعة من الخلايا الجسم الفطر كينيون (السهم)، حيث أظهرت أن الخلايا العصبية من الضروري للتعلم الشمية اليرقات. F) NP7493 هو مثال على وجود نمط غير محددة نسبيا التعبير التي تشمل عدة مجموعات من الخلايا العصبية النامية (الأسهم) التي من شأنها أن تفرق أكثر من خلال التحول لتشكيل دماغ الذبابة. على نطاق والحانات = 50 ميكرومتر.

الشكل 5
الشكل 5. نظرة عامة تلخص المحاولات الناجحة لدراسة التعلم النقابي في Drosophila اليرقات. ويمكن استخدام محفزات حاسة الشم وكذلك ضوء كحافز مكيفة لتترافق مع مكافأة إما أو المهينة (المثير غير الشرطي). محفزات مجزية تشمل السكر وتركيزات منخفضة من الملح؛ المحفزات تشمل معاقبة تركيزات عالية من الملح، الكينين، الصدمة الكهربائية، والحرارة، والاهتزاز من خلال التحفيز الميكانيكي (الطنين) وعلى ضوء 11،12،17-24. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

GAL4 / UAS يبني غالبا ما تستخدم في المختبر
الاختصار بروتين وظيفة أدب
تصور
UAS GFP-mCD8 :: نيون الخضراء البروتين membRANE علامة لي وآخرون، 1999
UAS-N-SYB :: GFP نيون الخضراء البروتين قبل المشبكي علامة ايتو وآخرون، 1998
UAS GFP-Dscam17.1 :: نيون الخضراء البروتين بعد المشبكي علامة وانغ وآخرون، 2004
UAS GFP-NLS :: نيون الخضراء البروتين جسم الخلية علامة روبرتسون وآخرون، 2003
إشارات التداخل مع العصبية
UAS-اختبأ رئيس ارتداد معيبة يستحث موت الخلايا المبرمج تشو وآخرون، 1997
UAS-امتاز حصادة يستحث موت الخلايا المبرمج تشو وآخرون، 1997
UAS-TS شي المهيمن السلبية dynamin كتل vesiclه إعادة التدوير Kitamoto، 2001
UAS-Kir.2.1 :: EGFP تصحيح باطنه K + القناة لا غشاء إزالة الاستقطاب بينز وآخرون، 2001
UAS-TRPA1 قناة الموجبة درجة الحرارة يعتمد التنشيط روزنزويج وآخرون، 2005
UAS-ChR2 Channelrhodopsin يعتمد التنشيط ضوء Schroll وآخرون، 2006

الجدول 1. بنيات UAS المستجيب غالبا ما تستخدم في المختبر لتصور التشريح العصبي والتلاعب انتقال متشابك 25-33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الإعداد وصفها في يرقات ذبابة الفاكهة يسمح للتحقيق في التعلم حاسة الشم النقابي داخل الدماغ الابتدائية نسبيا. هذا النهج هو بسيط، ورخيصة وسهلة لإنشاء مختبر في ولا تتطلب تكنولوجيا عالية 9. نقدم نسخة من التجربة، لدراسة التعلم النقابي مشهي معززة مكافأة الفركتوز 11. ويستند الإعداد الموضحة في سلسلة من الدراسات التي حققت parametrical شامل الاختلافات في عدد من التجارب والتدريب، وفحص واحد مقابل الفحص الشامل، والوقت الاحتفاظ والروائح المستخدمة وتركيزات رائحة ونوع الجنس 9،15،34،35. وهكذا، فإن الإعداد يصور السلوكية يدمج هذه المعلومات في نهج استنساخه بشكل استثنائي لدراسة وظائف المخ العليا في ذبابة الفاكهة. في نهاية المطاف، على أساس الإعداد لها بسيطة يمكن التأثير مكافأة أو معاقبة أي مادة اختبار ذوبان بسهولة مع هذا الاختبار.

ve_content "> وبالإضافة إلى ذلك، نشرت مؤخرا عدة بدائل لنموذج التي تسمح بالتحقيق في التعلم البصري النقابي في يرقات 23،36 (التي أنشئت في جربر وآخرون (2004).)، والصعق بالكهرباء، والضوء والحرارة الكينين، أو كما تم تطبيقها بنجاح والاهتزازات المعززات مكره للتعلم الشمية النقابي 9،17،19-21،37-40. وهكذا، مجموعة شاملة من الاجهزة التجريبية موجود لتحليل أساس السلوكية، والعصبية الجزيئية للتعلم والذاكرة في يرقات ذبابة الفاكهة ( الشكل 5) 13،14،41،42. هنا، وركزنا بشكل خاص على سكر الفواكه، رائحة التعلم نظرا لمتانة الفحص ومؤشرات الأداء العالي نسبيا التي يمكن تحقيقها، وخاصة بعض المتغيرات السلوكية تؤدي إلى مكره صغيرة فقط التغييرات، وهذا إلى حد ما حدود تطبيق الأسلوب، إلى جانب قضايا التنمية من الحيوانات التي تجعل الدراسات على المدى الطويل اليرقاتالمستحيل ليس الذاكرة.

الدماغ يتكون من اليرقات حوالي 10000 فقط الخلايا العصبية في مجملها. وبالتالي نتيجة لتنظيمها النسبية بسيطة (من حيث العدد) فإنه يمكن الوصول بشكل جيد إلى التدخل الجيني، وهذا بدوره يسمح للدراسات العليا على أساس الجزيئية والخلايا العصبية للتعلم والذاكرة. وخاصة أنظمة GAL4/UAS وتعديلاته الأخيرة تسمح للتلاعب الجيني للمجموعات محددة من الخلايا العصبية وما فوق. إلى الخلايا حتى واحد بطريقة المكانية والزمانية (الشكل 4) 7،10 هنا مجموعة شاملة من خطوط المستجيب توفر إمكانية لتصور هذه المجموعات من الخلايا العصبية يعرف (الشكل 4) 25،43، أو بدلا من التلاعب إنتاجها العصبية (الجدول 1). في معظم الأحيان يتم تطبيق المستجيب الجينات التي يمكن أن تحفز الخلايا بشكل مستقل أو منع موت الخلايا العصبية انتقال 29،30،33. وفي الآونة الأخيرة تم تطوير التكنولوجيات التي آلمنخفضة لتنشيط اصطناعية من الخلايا العصبية تسيطر يقودها ضوء أو الحرارة (الجدول 1) 31،32،44.

وباختصار، فإن الجمع بين طرق متطورة من التدخل الجيني وتجارب وصفها هنا السلوكية تسمح كشف أساس العصبية، الجزيئية والسلوكية للتعلم والذاكرة في الدماغ الأولية لليرقات ذبابة الفاكهة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نحن نريد بصفة خاصة أن أشكر أعضاء مختبر جربر للحصول على إرشادات الإعداد الخاصة بهم على التقنية التجريبية وتعليق على المخطوطة. نشكر أيضا ليوبوف Pankevych للرعاية الطيران وصيانة المخزون نوع كانتونات البرية. ويدعم هذا العمل من قبل TH1584/1-1 منحة DFG، ومنحة SNF 31003A_132812 / 1 وZukunftskolleg من جامعة كونستانز (AST لجميع).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fructose Sigma 47740 57-48-7
NaCl Fluka 71350 7647-14-5
Agarose Sigma A5093 9012-36-6
1-octanol Sigma 12012 111-87-5
Amylacetate Sigma 46022 628-63-7
Paraffin oil Sigma 18512 8012-95-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pawlow, I. P. New Researches on Conditioned Reflexes. Science. 58, 359-361 (1923).
  2. Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat. Rev. Neurosci. 4, 266-275 (2003).
  3. Kandel, E. R. Cellular insights into behavior and learning. Harvey Lect. 73, 19-92 (1979).
  4. Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 737-744 (2004).
  5. Milner, B., Squire, L. R., Kandel, E. R. Cognitive neuroscience and the study of memory. Neuron. 20, 445-468 (1998).
  6. Keene, A. C., Waddell, S. Drosophila olfactory memory: single genes to complex neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 8, (2007).
  7. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  8. Gerber, B., Stocker, R. F., Tanimura, T., Thum, A. S. Smelling, tasting, learning: Drosophila as a study case. Results Probl. Cell. Differ. 47, 139-185 (2009).
  9. Gerber, B., Stocker, R. F. The Drosophila larva as a model for studying chemosensation and chemosensory learning: a review. Chem. Senses. 32, 65-89 (2007).
  10. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  11. Gerber, B., Hendel, T. Outcome expectations drive learned behaviour in larval Drosophila. Proc. Biol. Sci. 273, 2965-2968 (2006).
  12. Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
  13. Pauls, D., Selcho, M., Gendre, N., Stocker, R. F., Thum, A. S. Drosophila larvae establish appetitive olfactory memories via mushroom body neurons of embryonic origin. J. Neurosci. 30, 10655-10666 (2010).
  14. Selcho, M., Pauls, D., Han, K. A., Stocker, R. F., Thum, A. S. The role of dopamine in Drosophila larval classical olfactory conditioning. PLoS One. 4, e5897 (2009).
  15. Neuser, K., Husse, J., Stock, P., Gerber, B. Appetitive olfactory learning in Drosophila larvae:effects of repetition, reward strength, age, gender, assay type and memory span. Animal Behaviour. 69, 891-898 (2005).
  16. Scherer, S., Stocker, R. F., Gerber, B. Olfactory learning in individually assayed Drosophila larvae. Learn Mem. 10, 217-225 (2003).
  17. Aceves-Pina, E. O., Quinn, W. G. Learning in normal and mutant Drosophila larvae. Science. 206, 93-96 (1979).
  18. Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. J. Neurogenet. 2, 1-30 (1985).
  19. Khurana, S., Abu Baker, M. B., Siddiqi, O. Odour avoidance learning in the larva of Drosophila melanogaster. J. Biosci. 34, 621-631 (2009).
  20. Pauls, D., et al. Electric shock-induced associative olfactory learning in Drosophila larvae. Chem. Senses. 35, 335-346 (2010).
  21. Eschbach, C., et al. Associative learning between odorants and mechanosensory punishment in larval Drosophila. J. Exp. Biol. 214, 3897-3905 (2011).
  22. von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
  23. Gerber, B., et al. Visual learning in individually assayed Drosophila larvae. J. Exp. Biol. 207, 179-188 (2004).
  24. Rohwedder, A., et al. Nutritional Value-Dependent and Nutritional Value-Independent Effects on Drosophila melanogaster Larval Behavior. Chem. Senses. (2012).
  25. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
  26. Ito, K., et al. The organization of extrinsic neurons and their implications in the functional roles of the mushroom bodies in Drosophila melanogaster Meigen. Learn Mem. 5, 52-77 (1998).
  27. Wang, J., et al. Transmembrane/juxtamembrane domain-dependent Dscam distribution and function during mushroom body neuronal morphogenesis. Neuron. 43, 663-672 (2004).
  28. Robertson, K., Mergliano, J., Minden, J. S. Dissecting Drosophila embryonic brain development using photoactivated gene expression. Dev. Biol. 260, 124-137 (2003).
  29. Zhou, L., et al. Cooperative functions of the reaper and head involution defective genes in the programmed cell death of Drosophila central nervous system midline cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5131-5136 (1997).
  30. Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
  31. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
  32. Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
  33. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  34. Chen, Y. C., Mishra, D., Schmitt, L., Schmuker, M., Gerber, B. A behavioral odor similarity "space" in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 237-249 (2011).
  35. Saumweber, T., Husse, J., Gerber, B. Innate attractiveness and associative learnability of odors can be dissociated in larval Drosophila. Chem. Senses. 36, 223-235 (2011).
  36. von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. (2011).
  37. Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Induction of cAMP response element-binding protein-dependent medium-term memory by appetitive gustatory reinforcement in Drosophila larvae. J. Neurosci. 25, 7905-7913 (2005).
  38. Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. Distinctive neuronal networks and biochemical pathways for appetitive and aversive memory in Drosophila larvae. J. Neurosci. 29, 852-862 (2009).
  39. Khurana, S., et al. Olfactory Conditioning in the Third Instar Larvae of Drosophila melanogaster Using Heat Shock Reinforcement. Behav. Genet. 42, 151-161 (2012).
  40. Tully, T., Cambiazo, V., Kruse, L. Memory through metamorphosis in normal and mutant. 14, 68-74 (1994).
  41. Michels, B., et al. Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning. Learn Mem. 18, 332-344 (2011).
  42. Saumweber, T., et al. Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47. J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).
  43. Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186, 735-755 (2010).
  44. Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).
مشهي التعلم النقابي في الشم<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Apostolopoulou, A. A., Widmann, A., Rohwedder, A., Pfitzenmaier, J. E., Thum, A. S. Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (72), e4334, doi:10.3791/4334 (2013).More

Apostolopoulou, A. A., Widmann, A., Rohwedder, A., Pfitzenmaier, J. E., Thum, A. S. Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (72), e4334, doi:10.3791/4334 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter