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Neuroscience

欲求联想嗅觉学习 doi: 10.3791/4334 Published: February 18, 2013

Summary

果蝇幼虫能联想到刺激气味,味觉奖励。在这里,我们描述了一个简单的行为范式,使食欲关联嗅觉学习分析。

Abstract

在下面,我们将介绍的食欲联想在果蝇嗅觉学习方法的细节。的设置,与遗传干扰的组合,提供了一个手柄来分析在一个简单的幼虫脑特异性关联学习的神经细胞和分子的基本面。

生物可以用过去的经验来调整现在的行为。这种行为的潜在的收购可以定义为学习,这些记忆痕迹的潜力,1-4的物理基础。神经科学家试图了解这些过程是如何组织的分子和神经元在大脑中的变化,通过使用各种方法模式生物,从昆虫到脊椎动物5,6。对于这样的努力是有帮助的使用是简单和实验模型系统,。 果蝇幼虫已被证明是满足这些需求的基础上提供强大的行为分析,存在的各种转基因技术的基本组织的神经系统,包括约10000个神经元(虽然与一些让步:认知的限制,一些行为的选择,和丰富的经验可疑)7-10

果蝇幼虫可以形成协会气味和食欲的味觉增强,如糖​​11-14之间。在一个标准的检测,在实验室中成立B.格柏,动物收到两气味的倒数培训:第一组的幼虫接触到的气味,连同与味觉增强剂(白糖奖励),随后接触到的气味B没有加固9。同时接收倒数第二组的幼虫经历气味A的训练,而没有加固,随后暴露于气味乙加固(糖的奖励)。在下面的两个群体是工商业污水附加费特德自己的喜好两者之间的气味。相对较高的奖励气味的偏好反映联想学习 - 的性能指数(PI)。有关的各项性能指标的关联性的结论是令人信服的,因为除了从应急的气味和促味剂,其它参数,如气味和奖励曝光,通过时间和处理没有显着差异,两组9。

Protocol

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1。准备

  1. 果蝇野生型幼虫被提出,在25°C和60%-80%的湿度在14/10光/暗周期。对于控制的确切年龄的幼虫始终成一小瓶(6厘米的高度和直径2.5 cm),其中包括约6毫升的标飞的食物,男10例,女20例。苍蝇产卵12小时,并在第二天被转移到一个新的小瓶。 5-6天后产蛋幼虫达到馈送第三龄期,如果在25℃引发,现在可以被用于行为实验。然而,一个具有确保只幼虫,仍然是在食品和不是从侧面的小瓶的幼虫。这些幼虫已经达到了“流浪3龄阶段” -在短期内化蛹前-和它们的用法的解释复杂化的结果。
  2. 制备的2.5%琼脂的培养皿中(其他实验室用1%的琼脂浓度在整个实验过程中,如何越来越低的浓度可能允许投喂3 幼虫挖底物):称取2.5 g琼脂糖凝胶在100毫升DDH 2 O烧热在微波炉中的溶液,直到它开始沸腾。小心地搅拌溶液,将它放入微波炉加热,直到所有的琼脂糖溶解。倒入热的琼脂糖溶液倒入培养皿的陪替氏培养皿的底部,使得被完全覆盖的琼脂糖溶液形成光滑的表面。让溶液冷却至室温,并关闭盖子。不要马上关闭盖子,因为这将允许冷凝水的盖子。
  3. 2M果糖培养皿的制备:称取2.5 g琼脂糖在100毫升DDH 2 O(再次,使用1%的琼脂浓度是可能的,但它可能会允许饲养3龄幼虫挖成的底物)。烧热在微波炉中的溶液,直到它开始沸腾。仔细搅拌解决方案,并把它放回微波,直到所有的琼脂糖溶解。小心热溶液中加入35克的果糖,,慢慢搅拌混合物,直到糖溶解,避免沸腾迟缓。倒入热的果糖琼脂糖溶液倒入陪替氏培养皿的底部,使得被完全覆盖和果糖的琼脂糖溶液形成光滑的表面。让溶液冷却至室温,并关闭盖子。不要马上关闭盖子,因为这将允许冷凝水的盖子。
  4. 制备的1 - 辛醇(OCT)的气味容器:填写10微升纯十月到一个定制特氟隆气味容器和关闭它的盖,有几个小的孔,以允许蒸发的气味。容器的详细描述给定的格柏和施托克尔2007中。准备三个气味容器10月。气味容器允许插入的化学品的蒸发,但避免幼虫可以直接联系他们。因此,在这里描述的实验的具体解决嗅觉学习,幼虫不会扰动味觉的副作用。
  5. 戊酯(AM)的气味容器的制备:取AM 1:50石蜡油。填充到一个自定义自制特氟隆气味容器的稀释液的10微升,并关闭它的盖,有几个小的孔,以允许蒸发的气味。准备三个气味的容器AM。的稀释是很重要的现实的原因,即避免强烈的气味比其他可能掩盖了学习相关的变化,两者之间的相对偏好气味的偏好。两个气味的平等的吸引力可能需要将之前的实验中,通过施加与天真动物的稍后描述的测试(2.5)在实验室中证实。这里介绍的值是基于一些出版物的Gerber实验室最近被复制我们的实验室9,15,16。
  6. 标签的培养皿中的行为学实验之前,所有的培养皿中进行编码。这意味着,果糖含有培养皿有被标记为与一个“X”或一个“A”和琼脂糖只培养皿与​​一个“Y”或“B”的例子。此代码应该被揭露出来后,所有数据都被记录的实验者。通过执行实验“盲”,因此不可能的实验者的预期可能会影响性能的幼虫。为了简化理解为广大的读者,下面我们将谈论的气味作为条件刺激(CS1,CS2),奖励时,果糖培养皿(+)或无报酬时,仅琼脂糖陪替氏培养皿( - )。

2。糖奖励培训和测试

  1. 收集30投喂3 幼虫的食品瓶。转入他们的第一个培养皿中,包含了一些滴自来水,小心地向前和向后移动,用刷子。将它们传输到第二个培养皿中,也包含了一些滴自来水华盛顿,以检查,没有食物糊仍然幼虫的体壁,,否则幼虫将能够在实验过程中体验到食物的气味。这可能会掩盖在学习过程中,他们的表现在测试的情况。
  2. 培训:培训幼虫相关联的气味,食欲糖提示下制度。沽上的左右侧的一个“X”标记的OCT气味容器-因此,含果糖奖励的陪替氏培养皿(+)(“盲”实验中,详细信息,请参阅1.6)。组30投喂3 幼虫上的培养皿中,盖上盖子,等待5分钟,而动物暴露华侨城。确保幼虫被困在里面的水滴,可以克服表面张力的。 ,幼虫可以自由移动培养皿上,体验嗅觉和/或味觉的刺激。
  3. 培训:从培养皿中取出幼虫用湿刷和转移米到第二培养皿]是与一个“Y”标记-因此,琼脂糖只( - )含有培养皿-和位于它的左侧右侧的容器具有的AM气味。盖上盖子,等待5​​分钟,而动物暴露于AM。
  4. 培训:重复2.2)和2.3)的两倍,所有30个幼虫经历了三个训练周期:CS1 /(+) - CS2 /( - ),(+) - CS1 / CS2 /( - ); CS1 /(+) - CS2 /( - )。在这个实验中,,CS1表示OCT和CS2代码为AM。
  5. 测试:将一个AM和一个OCT气味,容器的网站的琼脂糖只的培养皿上的反对。受过训练的动物转移到测试培养皿中间。盖上盖子,等待5​​分钟。随后的幼虫的数目进行计数的左侧,中间和右侧的侧的测试培养皿。
  6. 重复步骤2.1)2.5),第二组30投喂3 幼虫,但交换实验的角色的AM和华侨城等,这些动物会收到以下培训:CS2/(+) - CS1 /( - ); CS2 /(+) - CS1 /( - ); CS2 /(+) - ( - )CS1 /。在这个实验中,,CS1表示OCT和CS2代码为AM。
  7. 可能安排的培训。以上我们提出了一个培训存在的三个培训试验或OCT /(+) - AM /( - )/( - )或在对等组的三个培训试验的AM /(+) - OCT。然而,为了避免在训练序列依赖性的影响,重要的是不同的序列的以下重复完整的实验中的刺激。通过改变CS1或CS2顺序和奖励文稿在所述第一或第二呈现板,四个不同的序列的训练试验是可能的:
第一组 CS1 /(+) - CS2 /( - ) 交换组 CS2 /(+) - CS1 /( - )
CS1 /( - ) - CS2 /(+) CS2 /( - ) - CS-1 /(+)
CS2 /(+) - CS2 /( - ) CS1 /(+) - CS2 /( - )
CS2 /( - )(+) - CS1 / CS1 /( - ) - CS2 /(+)

为了防止系统的周边的实验环境刺激的影响,应该执行其中之一的测试中的二分之一的情况下的条件,使得OCT提出,在左边和AM到右侧。在其他的情况下的一半AM应呈现在左侧和OCT在右边。

3。测试任务相关的感官电机学院

上述实验的设计允许在野生型馈送3龄幼虫,在其自己的分析臭味糖学习。然而,在日常的实验室生活研究者通常使用两个或更多个不同的实验组的幼虫的比较,如果嗅觉学习取决于看齐在开发过程中添加满足特殊基因,一组特定的神经细胞,突变体的股票,一种特殊的食品的饮食,不同的饲养条件下,有毒化学品,等等。因此,在所有情况下,当两个或多个测试实验组的幼虫做了强制控制实验来测试,如果不同群体的幼虫显示正确的感觉运动视力。这将成为强制性的,并不一定是由于潜在的表型是减少或取消的能力,联营公司与糖的气味。相反,可以根据潜在的学习缺陷的缺陷,在感官电机电路的任何步骤中的处理中的气味和/或糖。或者换句话说,如果一个突变的幼虫是无法感测糖,它不能建立一个糖存储器。但是,这并不让得出的结论是,幼虫不能学习。详细的对照实验,测试OCT,AM和果糖,适当处理的转基因幼虫,有许多工作要做。

1。测试天真OCT preference

收集30投喂3 幼虫的食品瓶。仔细地把它们洗干净的自来水2.1。琼脂糖培养皿中的一个侧面上,提出一个单一的的的OCT气味容器的幼虫上的培养皿中,盖上盖子,等待5​​分钟,这样,幼虫可抓取的培养皿东方对OCT气味源。随后幼虫的数目进行计数的左侧,中间和测试的陪替氏培养皿上的右侧。

2。为天真AM偏好测试

收集30投喂3 幼虫的食品瓶。仔细地把它们洗干净的自来水2.1。琼脂糖培养皿中的一个侧面上,提出一个单一的AM气味容器的幼虫上的培养皿中,盖上盖子,等待5​​分钟,这样,幼虫可抓取的培养皿东方对AM气味源。随后数一数升arvae的左侧,中间和测试的陪替氏培养皿上的右侧。

3。测试幼稚糖偏好

收集30投喂3 幼虫的食品瓶。仔细地把它们洗干净的自来水2.1。准备陪替氏培养皿在一个一半和2M果糖琼脂糖混合物中的另一半,包含2.5%的琼脂糖。添加到培养皿中的幼虫,盖上盖子,等待5​​分钟,这样,幼虫可抓取的的培养皿东方向的果糖含侧。随后幼虫的数目进行计数的左侧,中间和测试的陪替氏培养皿上的右侧。

制备的一半半培养皿:准备上述1.2节中的普通琼脂糖平板。当琼脂糖填充培养皿被冷却下来,仔细切断琼脂糖用手术刀沿垂直轴。删除一半的琼脂糖从陪替氏培养皿中。一西元一个热果糖的琼脂糖溶液(制备见1.3)的陪替氏培养皿的空半。要特别小心,两个半匹配,并没有形成一个定义的边缘-这会影响幼虫的选择行为,使行为分析相当困难的。4。

深培训

尽管测试,如果转基因投喂3 幼虫最近一直在野生型水平之间的OCT和空气(3.1),AM和空气(3.2)和糖和纯琼脂糖(3.3),一组额外的测试实验能够区分介绍(讨论Gerber和斯托克,2007年)。这些实验的基本原理如下。在培训期间幼虫进行大量的处理和连续的气味和糖刺激。因此,这是非常可能的,所观察到的学习表型是误导性的(虽然天真气味和糖感知试验上的野生型水平!)。事实上,它是可能的转基因动物ðiffer从野生型幼虫的抗应激能力,动机,疲劳,感觉适应,情境学习和饱腹感的变化。因此,米歇尔斯等人 (2005)提出控制测试是否一个给定的突变体能够:(1)检测AM与一个空气味容器中的幼虫,如果你把在训练中完全一样,除非你省略的奖励,而只是暴露在两个气味;(4(2)检测后,同样的制度,OCT(3)检测与一个空气味容器上午,如果你对幼虫的培训方式,除非你忽略的气味,仅仅暴露的奖励; )检测到十月后,相同的方案。对于一个全面的讨论和方法的进一步详细信息,请参阅米歇尔斯等人 (2005年)和Gerber和储(2007)。

4。数据分析糖悬赏学习

  1. 为了评估糖奖励学习协议的数据计算出OCT偏好指数(PREF OCT)的每个的两个往复运动美云的训练组:
    第一组接受OCT /(+) - AM /( - )培训:
    PREF华侨城(OCT + / AM)=(的幼虫在OCT侧的 - #幼虫AM侧)/所有的幼虫在左,右,中区
    对于第二组,AM /(+) - OCT /( - )培训:
    PREF调幅(AM + / OCT)=(#AM侧 - #幼虫幼虫在OCT侧)/#的所有幼虫在左,右,中区
  1. 计算性能指数(PI)两个PREF值4.1)。的PI联想学习的气味和惩罚暴露的时间和处理,通过消除扰动的影响:
    PI =(PREF华侨城(OCT + / AM)+:PREF AM(AM + / OCT))/ 2
    因此,督察范围从-1到1之间。显着的负值代表厌恶学习,而显着的正面的价值观描述食欲的学习。一个完整的实验通常包括10个或更多的督察。数据可视化的箱线图includin克的所有值给定的实验组。位于内盒的50%的值被表示为粗线内的箱形图的性能指标中位数。

5。数据分析任务相关的感官电机学院

  1. 评估数据进行测试时,适当的的OCT气味处理计算OCT气味的偏好指标如下:
    气味PREF华侨城(OCT侧的幼虫 - 幼虫的另一边)= /#的所有幼虫在左,右,中区
  2. 评估数据进行测试时,进行适当的AM的气味感知计算AM气味的偏好指标如下:
    气味PREF AM =(AM侧的幼虫 - 幼虫的另一边)/左,右和中间区域内的所有幼虫
  3. 评估时的数据测试适当的果糖感知的计算的果糖偏好指数如下:
    PREF果糖=(#幼虫的另一边的幼虫果糖侧 -)/#内的左,右和中间区的所有幼虫
  4. 假培训详情米歇尔斯等人,2005年中给出。

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Representative Results

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图1A示出了概述幼虫嗅觉联想学习的实验程序。通过配对两个气味之一与糖奖励幼虫获得表达朝向比较风范气味的奖励的气味中的一个有吸引力的响应潜在的行为。两组的幼虫始终的培训,通过配对的气味OCT或AM的增强剂。性能指数(PI)测量的相关功能之间的相互培训的群体偏好的差异。

在相关功能进行了分析,在转基因幼虫,基本感觉运动能力的测试是必需的。这是通过向他们提供的选择之间的填充气味容器和空气或纯琼脂糖和琼脂糖加上糖之间。 (深水培训,这里没有显示)。幼虫注意的最终分布在一个特定的数据表( 图2)和相ualized作为箱形图( 图3)。阳性结果表明有吸引力的选择行为的偏好指数和食欲的学习情况下的性能指标。负值表示厌恶的选择,行为偏好指数计算的情况下的性能指标和厌恶学习。

图1
图1。计划的行为实验来测量幼虫关联嗅觉学习,天真的嗅觉偏好和天真的味觉偏好。

  1. 30 果蝇饲养3龄幼虫放置五分钟,琼脂培养皿中含有糖悬赏200万果糖。在同一时间被设置在第一的气味的聚四氟乙烯容器中(OCT)。因此,幼虫可关联的刺激气味中的第一堂训练阶段,以积极的增强剂。接着,幼虫转移到的第二琼脂糖培养皿没有加强件,但再次5分钟的第二气味(AM)。培训被重复三次。最后,在测试的情况下测量的幼虫的奖励对非奖励琼脂糖培养皿上的气味的气味的气味偏好。这允许第一选择指数(PREF)的计算。甲幼虫的第二组中的往复运动的方式同样进行训练。在这里,一个第二优先级索引(PREF)可以计算出来。最后一个性能指数(PI),平均都偏好指数计算。试验的顺序的详细信息,请参阅2.7。
  2. 为了分析天真气味偏好,一个单一的气味OCT或AM充满容器置于一侧上的纯琼脂糖培养皿。 30投喂3 幼虫是解放军CED的陪替氏培养皿中的中间,并在5分钟后的分布的陪替氏培养皿上的幼虫进行计数。从得到的数据嗅觉偏好指数(PREF),然后计算出来的。
  3. 对于分析天真味觉偏好2M果糖的填充在一个一半的陪替氏培养皿,在其另一侧含有纯琼脂糖。 30馈送3龄幼虫被放置在陪替氏培养皿的中间,并在5分钟后的分布的陪替氏培养皿上的幼虫进行计数。从得到的数据,一个的味觉偏好指数(PREF),然后计算出来的。

图2
图2实施例的原始数据表A)糖奖励学习得到的,用于登记和处理数据,B)的幼稚气味的喜好和C)天真的味觉喜好。对于所有的实验中幼虫的左侧,中间和右侧的培养皿的数目被注明。出的信息偏好指数(PREF)计算的。幼虫学习被描述为性能指标(PI)来自computating两个相互培训,组的首选项。 点击此处查看大图

图3
图3。数据可视化A)糖奖励学习,B)天真气味的喜好和C)天真的味觉偏好。盒形图表示数据如下:中位数(粗体线内箱);框表示所有数据点的50%的,而上部和下部的晶须表示其他各25%。因此,没有离群值的最小和最大的值表示由晶须边界。离群值被描述为小圆圈,它们被定义为任何点的1.5倍以上,从第一和第三四分位数四分位数间距。单个数据点的统计分析采用Wilcoxon符号秩检验,而Wilcoxon秩和检验用于比较两个数据组。 NS为P> 0.05,*为P <0.05,**为P <0.01或***为p <0.001显着性水平表示。每个实验的样本大小为:N = 15。

A)的学习实验中总是偏好指数(PREF)的倒数实验计算出最终的性能指标(PI)。被描绘成箱线图相应的性能指数(PI)。


图4实施例的GAL4线其中每个标签幼虫的大脑内的一组特定的细胞。总是充满Z-预测的幼虫脑额叶的意见。神经元的特定数据集的由反在整个幼虫中枢神经系统,是可视化由anti-FasII/anti-ChAT doublestaining(品红)的绿色荧光蛋白(绿色)被标记为A)NP225标签二阶嗅觉神经元一组,称为投影神经元(箭头)和显影成人视觉系统(箭头),B)NP2426嗅的interneurons(箭头所示)的一组标记在第一嗅觉中继站,称为触角叶C)专门GR66a标签味觉的感觉神经元的一组项目周边味觉感官器官的到的subeosophageal的神经节(箭头所示),D)NP3128标签几套不同类型的神经元。类似的触角叶嗅觉的interneurons到B的箭头标记的箭头,突出了项目的多巴胺能神经元到神经纤维区域被称为蘑菇体。E)H24标记一组蘑菇体肯扬细胞(箭头),神经元显示是必要的幼虫嗅觉学习F)NP7493是相对非特异性的表达模式的一个例子,其中包括几套显影神经元(箭头),在变态过程中,将进一步区分,形成大脑的苍蝇。比例尺= 50微米。

图5
图5。概述总结了成功的尝试,学习联想学习 Drosophila幼虫。嗅觉刺激以及光可以用来作为条件刺激(无条件刺激)与任何奖励或处罚。奖励刺激包括糖和盐的低浓度的惩罚性刺激,包括高浓度的盐,奎宁,电击,热,机械性刺激,通过振动(巴斯)和光11,12,17-24。 点击此处查看大图

GAL4 / UAS建设中经常使用我们的实验室
缩写 蛋白质 功能 文学
可视化
UAS-mCD8 :: GFP 绿色荧光蛋白 MEMBRANE标记 Lee 等人,1999
UAS-N-SYB :: GFP 绿色荧光蛋白突触标记 Ito 等人,1998
UAS-Dscam17.1 :: GFP 绿色荧光蛋白突触标记 Wang 等人,2004
UAS-NLS :: GFP 绿色荧光蛋白细胞体标记 Robertson 等人,2003
神经信号的干扰
UAS-HID 头部退化缺陷诱导细胞凋亡 Zhou 等人 ,1997年
UAS-RPR 收割者诱导细胞凋亡 Zhou 等人 ,1997年
UAS市TS 显性负动力块vesiclË回收 2001年北本,
UAS-Kir.2.1 :: EGFP 内向整流K +通道没有膜的去极化贝恩斯等人,2001
UAS-TRPA1 阳离子通道温度依赖性激活罗森茨魏希等人,2005
UAS-CHR 2 Channelrhodopsin 依赖于光激活 schroll 等人,2006

表1。的 UAS效应结构经常被用来在实验室中以可视化的神经解剖和操作突触传递的25-33。

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Discussion

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果蝇幼虫所描述的设置允许关联嗅觉学习的同等小学大脑内的调查。方法很简单,价格便宜,易于在实验室建立的,并不需要高科技设备9。我们提出了一个版本的实验中,研究食欲联想学习,加强果糖奖励11。所描述的设置是根据一系列的参数化的全面的调查研究,训练试验的数目的变化的,单一的检测与质量测定,保留时间,使用的气味和气味的浓度和性别9,15,34,35。因此,所描述的行为的设置集成了这样的信息在一个的异常重复的方法来研究大脑高级功能的果蝇 。最终,基于任何可溶性物质奖励或惩罚的效果可以很容易地用这个方法测试其简单的设置。

ve_content“>此外,有几个不同的范式,最近公布的,允许调查关联的视觉学习中的幼虫23,36(成立于Gerber 等人 (2004年));和电击,光,热,奎宁或振动还成功实施作为关联嗅觉学习9,17,19-21,37-40的厌恶强化。因此,一套全面的实验装置存在的行为,在果蝇的学习和记忆的神经细胞和分子基础的分析( 图5)。在这里,我们专注于气味果糖学习的鲁棒性的分析和比较高的性能指标,可以实现13,14,41,42。特别是一些厌恶的变种,导致只有很小的行为变化,这在一定程度上的应用程序的方法,除了发展问题的动物,使幼虫的长期研究的限制内存中,而不可能。

幼虫大脑其全部由只有约10,000个神经元。因此,由于其相对简单的(数字)的组织是遗传的干扰,这反过来又使先进的研究学习和记忆的分子和神经元的基础上。尤其是GAL4/UAS系统和其最近的修改允许的遗传操作的定义的一组神经元高达甚至单细胞在时空的方式( 4)7,10。特此效应线提供了一套全面的的可能性可视化这些定义的一组神经元( 4),25,43,或者操纵他们的神经元的输出( 表1)。最常见的效应基因的细胞自主性,可以诱导细胞死亡或抑制神经传导29,30,33。最近技术被开发出来,人为低电平,为受控的人工激活的神经元,通过光或温度( 1)31,32,44驱动。

综上所述,结合的复杂遗传的干扰,以及这里所描述的行为实验的方法,让揭示的学习和记忆的基本果蝇的大脑中的神经细胞,分子和行为基础。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

我们要特别感谢他们的实验装置和意见的手稿上的技术指导,的格柏实验室的成员。我们也感谢柳博芙·Pankevych飞的维修保养及野生型各州股票。这项工作是支持的DFG授予,的SNF授予31003A_132812 / 1和康斯坦茨大学的Zukunftskolleg(TH1584/1-1所有的AST)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fructose Sigma 47740 57-48-7
NaCl Fluka 71350 7647-14-5
Agarose Sigma A5093 9012-36-6
1-octanol Sigma 12012 111-87-5
Amylacetate Sigma 46022 628-63-7
Paraffin oil Sigma 18512 8012-95-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Apostolopoulou, A. A., Widmann, A., Rohwedder, A., Pfitzenmaier, J. E., Thum, A. S. Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (72), e4334, doi:10.3791/4334 (2013).More

Apostolopoulou, A. A., Widmann, A., Rohwedder, A., Pfitzenmaier, J. E., Thum, A. S. Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (72), e4334, doi:10.3791/4334 (2013).

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